TCF12 Activates TGFB2 Expression to Promote the Malignant Progression of Melanoma

doi:10.3390/cancers15184505

.2023年9月11日；15(18):4505.

doi:10.3390/cancers15184505。

TCF12激活TGFB2表达促进黑色素瘤恶性进展

田友佳^1 2, 江洲^三, 鑫鑫柴^1 2, 泽君平^1 2, 赵玉荣^1 2, Xin Xu（新旭）^1 2, 池洛（Chi Luo）⁴, 盛景浩^1 2 三 4

附属公司

¹浙江大学医学院附属杭州第一人民医院，杭州310006，中国。
²浙江大学良渚实验室，杭州310012，中国。
^三浙江大学肿瘤中心，杭州310058，中国。
⁴浙江大学医学院生物电磁学浙江省重点实验室，杭州310058。

PMID： 37760480
预防性维修识别码：项目编号10527220
内政部： 10.3390/癌症15184505

TCF12激活TGFB2表达促进黑色素瘤恶性进展

田友佳等。癌症（巴塞尔）. 2023.

.2023年9月11日；15(18):4505.

doi:10.3390/cancers15184505。

作者

田有佳^1 2, 江洲^三, 鑫鑫柴^1 2, 泽君平^1 2, 赵玉荣^1 2, Xin Xu（新旭）^1 2, 池洛（Chi Luo）⁴, 盛景浩^1 2 三 4

附属公司

¹浙江大学医学院附属杭州第一人民医院，杭州310006，中国。
²浙江大学良渚实验室，杭州310012，中国。
^三浙江大学肿瘤中心，杭州310058，中国。
⁴浙江大学医学院生物电磁学浙江省重点实验室，杭州310058。

PMID： 37760480
预防性维修识别码：项目编号10527220
内政部： 10.3390/癌症15184505

摘要

黑色素瘤是最常见的恶性肿瘤之一，对人类健康构成严重威胁。一半以上的黑色素瘤患者有BRAF突变，其中90%的患者有BRAF（V600E）突变。有一种针对使用BRAF（V600E）抑制剂的患者的靶向治疗方法。然而，由于黑色素瘤的异质性，治疗无反应通常是不可避免的。再加上其高转移性，黑色素瘤最终导致整体生存率低下。本研究旨在探讨黑色素瘤转移的可能机制，并确定一种更有效的治疗黑色素瘤的方法。本文通过分析TCGA的数据，我们报告了TCF12在黑色素瘤中的表达更高，尤其是在转移性肿瘤中。然后，细胞增殖、集落形成和transwell分析表明，TCF12的上调表达可以促进体外黑色素瘤细胞的增殖和转移。皮下肿瘤形成试验也证实了同样的结果。此外，通过RNA-seq、qPCR、免疫印迹、ChIP和双荧光素酶报告测定，TGFB2被鉴定为TCF12的直接下游靶标。有趣的是，TCF12的缺失可以使黑色素瘤在体外和体内对BRAF抑制敏感。总的来说，我们的结果表明TCF12促进黑色素瘤进展，并可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。

关键词：BRAF（V600E）；RNA-seq；TCF12；TGFB2；黑色素瘤。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
TCF12表达与黑色素瘤进展和患者预后不良相关：(一)与正常皮肤样本相比，黑素瘤组织中TCF12表达的箱线图，数据来源于癌症基因组图谱（TCGA）数据库；(b条)Kaplan−Meier生存分析比较TCF12表达水平高低分组的黑色素瘤患者的总体生存率；(**c（c）**,d日)利用TCGA数据库分析原发性黑色素瘤与转移组织中TCF12的相对表达(**c（c）**)和GSE65904数据集(d日); (**e（电子）**)不同阶段黑色素瘤TCF12表达水平的比较分析：放射生长期（RGP）、垂直生长期（VGP）和转移期（Met）。统计学显著性是基于与RGP组的比较；(**（f）**,克)黑色素瘤组织样本中TCF12免疫组化（IHC）染色的代表性图像（红色方块，200×；黑色方块，400×）(**（f）**)和相应的组织学分析，量化TCF12蛋白水平(克). 比例尺：100μm。统计显著性基于图表中所示的比较。

图2
TCF12增强体外黑色素瘤细胞增殖和体内致瘤性：(一,b条)定量PCR(一)和免疫印迹(b条)TCF12敲除后YUMM1.7细胞株TCF12水平分析。shScr：对照shRNA，shTcf12-1/2：小鼠TCF12-specific shRNA；(**c（c）**,d日)细胞增殖(**c（c）**)和菌落形成能力(d日)TCF12敲除细胞与对照细胞的比较；(**e（电子）**)注射TCF12敲除的YUMM1.7细胞小鼠的肿瘤生长曲线，n=6只/组；(**（f）**)来自对照（shScr）和TCF12敲低（shTcf12-1）小鼠的代表性肿瘤图像；(克)对照组和TCF12敲除组肿瘤重量的比较；(小时,我)Ki67免疫组化染色代表性图像（红方，200×；黑方，400×）(小时)和后续分析(我)在肿瘤组织中。比例尺：50μm。统计显著性基于与shScr组的比较*第页< 0.05, **第页< 0.01.

图3
TCF12促进黑色素瘤细胞迁移、体外侵袭和体内转移：(一,b条)代表性图像（红色方块，200×；黑色方块，400×）(一)和细胞计数分析(b条)TCF12敲除后YUMM1.7细胞的跨阱迁移和Matrigel侵袭检测。shScr：对照shRNA，shTcf12-1/2：小鼠TCF12-specific shRNA；(**c（c）**,d日)代表性图像（红色方块，200×；黑色方块，400×）(**c（c）**)和细胞计数分析(d日)TCF12过度表达后YUMM1.7细胞的跨阱迁移和Matrigel侵袭检测。EV：空向量表达式；Tcf12：小鼠Tcf12过度表达；(**e（电子）**)尾静脉注射TCF12击倒YUMM1.7细胞后小鼠的Kaplan-Meier生存曲线，n=6/组；(**（f）**——小时)肺转移瘤的典型图像(**（f）**)肺切片苏木精伊红染色(小时)以及肿瘤结节的数量(克)小鼠尾静脉注射对照组（shScr）和TCF12敲除组（shTcf12）YUMM1.7细胞。比例尺：100μm。注射对照（shScr）和TCF12敲低（shTcf12）YUMM1.7细胞的小鼠尾静脉中肺转移的代表性图像；(我——k个)肺转移瘤的典型图像(我)肺切片的H&E染色(k个)以及肿瘤结节的数量(j个)在注射对照（EV）和TCF12过度表达（TCF12）YUMM1.7细胞的小鼠尾静脉中，每组6只小鼠。比例尺：H&E染色时为100μm。统计显著性基于与shScr组或EV组的比较*第页< 0.05, **第页< 0.01.

图4
TGFB2是TCF12的下游目标：(一)通过RNA-seq（蓝色，基因下调；红色，基因上调）分析TCF12敲低（shTcf12-1）的YUMM1.7细胞与对照（shScr）的差异表达基因火山图；(b条,**c（c）**)基因本体（GO）丰富(b条)和KEGG途径(**c（c）**)TCF12基因敲除后差异表达基因的生物学过程分析；(d日,**e（电子）**)定量聚合酶链式反应(d日)和免疫印迹(**e（电子）**)TCF12基因敲除后YUMM1.7细胞TGFB2表达分析；(**（f）**,克)TCF12敲除小鼠黑色素瘤组织中TGFB2 IHC染色的代表性图像(克)或TCF12过度表达(**（f）**)（红色方块，200×；黑色方块，400×）。比例尺：50μm。统计显著性基于与shScr组的比较**第页< 0.01.

图5
TCF12直接绑定并激活*Tgfb2型*发起人：(一)染色质免疫沉淀（ChIP）结合qPCR分析显示TCF12与*Tgfb2型*启动子在YUMM1.7细胞中，TCF12敲除后启动子减少；(b条)ChIP−qPCR分析显示TCF12与*Tgfb2型*TCF12过表达对YUMM1.7细胞启动子的影响；(**c（c）**)示意图显示了*Tgfb2型*具有野生型（WT）或E-盒缺陷序列的启动子驱动的萤光素酶报告子。荧光素酶活性测量并显示为折叠变化。统计显著性基于与对照组（shScr或EV）的比较**第页< 0.01.

图6
TGFB2对TCF12诱导的体外细胞增殖、迁移和侵袭至关重要：(一)TGFB2敲除后YUMM1.7细胞株TGFB2水平的qPCR分析。siScr：控制siRNA，siTgfb2-1/2:TGFB2击倒siRNA；(b条)TGFB2敲低、TCF12过度表达或两者联合作用的YUMM1.7细胞的细胞增殖分析；(**c（c）**,d日)代表性图像（红色方块，200×；黑色方块，400×）(**c（c）**)和细胞计数分析(d日)通过TGFB2敲除、TCF12过度表达或其组合，对YUMM1.7细胞进行跨阱迁移和Matrigel侵袭检测。EV：空载体表达，Tcf12:Tcf12过表达，siScr：控制siRNA，siTgfb2:TGFB2−特异性siRNA。比例尺：100μm。统计显著性基于与对照组（Tcf12+siScr）的比较**第页< 0.01.

图7
MAPK通路抑制降低TCF12蛋白的稳定性：(一)PLX4032或曲美替尼作用24小时后A375细胞TCF12转录的qPCR分析；(b条)PLX4032或曲美替尼作用24小时后A375细胞TCF12蛋白的免疫印迹分析α-Tub:α-tubulin作为内部对照；(**c（c）**,d日)PLX4032处理A375细胞不同时间点的TCF12蛋白稳定性分析。CHX：环己酰亚胺；(**e（电子）**)用PLX4032单独或与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理的A375细胞中TCF12蛋白的免疫印迹分析。

图8
TCF12的耗尽使黑色素瘤对BRAF抑制敏感：(一,b条)细胞增殖(一)和菌落形成(b条)TCF12敲除、PLX4032治疗或其联合治疗的细胞分析；(**c（c）**)注射TCF12敲除细胞和PLX4032治疗的小鼠肿瘤生长曲线，n=6只/组；(**c（c）**,克)肿瘤生长曲线(**c（c）**)，代表性肿瘤图像(d日)，肿瘤重量(**e（电子）**)，Ki67 IHC代表性图片（红色方块，200×；黑色方块，400×）(**（f）**)和后续分析(克)来自对照组（shScr+载体）、PLX4032治疗组（shScr+PLX4022）、TCF12击倒组（shTcf12-1+载体）及其组合（shTcf12-1+PLX4012）。比例尺：50μm。统计显著性基于与对照组的比较**第页< 0.01.

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