Phosphatase and Pseudo-Phosphatase Functions of Phosphatase of Regenerating Liver 3 (PRL-3) Are Insensitive to Divalent Metals In Vitro

doi:10.1021/acsomega.3c04095

.2023年8月9日；8(33):30578-30589.

doi:10.1021/acsomega.3c04095。 eCollection 2023年8月22日。

再生肝磷酸酶3（PRL-3）的磷酸酶和假磷酸酶功能对二价金属不敏感

杰弗里·乔利^1 2, Ty C Cheatham公司^1 2, 杰西卡·布莱克本^1 2

附属公司

¹美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学细胞与分子生物化学系，邮编：40536。
²肯塔基大学马基癌症中心，美国肯塔基州列克星敦40536。

PMID： 37636930
预防性维修识别码：项目经理10448674
内政部： 10.1021/acsomega.3c04095

再生肝磷酸酶3（PRL-3）的磷酸酶和假磷酸酶功能对二价金属不敏感

杰弗里·乔利等。 ACS欧米茄. 2023.

.2023年8月9日；8(33):30578-30589.

doi:10.1021/acsomega.3c04095。 eCollection 2023年8月22日。

作者

杰弗里·乔利^1 2, Ty C Cheatham公司^1 2, 杰西卡·布莱克本^1 2

附属公司

¹美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学细胞与分子生物化学系，邮编：40536。
²美国肯塔基州列克星敦肯塔基大学马基癌症中心，邮编：40536。

PMID： 37636930
预防性维修识别码：第10448674页
内政部： 10.1021/acsomega.3c04095

摘要

再生肝磷脂酶3（PRL-3）与肿瘤转移相关，并已被证明与细胞周期蛋白和CBS域二价金属阳离子转运介质（CNNM）家族蛋白相互作用，以调节镁和其他二价金属的细胞内浓度。尽管PRL-3在癌症中很重要，但调节PRL-3磷酸酶活性及其与CNNM蛋白相互作用的因素仍然未知。在此，我们表明，二价金属离子，包括镁、钙和锰，对PRL-3的结构、稳定性、磷酸酶活性或CNNM结合能力没有影响，表明PRL-3不起金属传感器的作用，尽管它与CNNM金属转运蛋白有相互作用。体外方法发现，PRL-3是一种广泛但不滥杀滥伤的磷酸酶，对二核苷酸和三核苷酸、磷酸肌醇和NADPH具有活性，但对其他常见代谢物没有活性。虽然预测了PRL-3活性位点附近的钙、镁、锰和锌结合位点，但这些二价金属并没有特异性地改变PRL-3的磷酸酶活性，也没有改变其从非活性磷半胱氨酸中间状态的转变，也没有直接与CNNM的CBS结构域结合。PRL-3对金属阳离子的不敏感性否定了其作为细胞内金属含量传感器调节CNNM活性的可能性。需要进行进一步的研究，以确定PRL-3磷酸酶活性和CNNM相互作用的调控机制，因为这些发现可能对癌症治疗具有潜在的治疗意义。

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图1
PRL-3可以去磷酸化大量非蛋白底物。孔雀石绿色试验用于确定PRL-3是否能使指示的合成底物、氨基酸、核苷酸、代谢物、，和磷脂。之后释放的无机磷酸盐量根据标准曲线计算1.5h培养时间。误差线表示标准偏差。显著性使用普通的单向方差分析（ANOVA）分析****第页<0.0001，比较PRL-3活性与磷酸酪氨酸磷酸-胺和磷酸-三氢嘌呤***第页<0.001，比较PRL-3活性与PI（4,5）P₂到其他磷脂酰肌醇底物，ns=无显著差异。

图2
PRL-3有许多预测金属结合位点。晶体结构使用金属离子结合位点预测和建模服务器（MIB2）。CBS域（黄色）在活动PRL-3的位置（灰色）。预测的钙、镁、锰和锌结合位点分别显示为橙色、蓝色、绿色和粉红色，PRL-3催化位点为红色。一些预测将金属直接在CNNM界面中的离子或与附近的离子相互作用PRL-3的活性部位和WPD回路。

图3
钙不会改变PRL-3的二级结构，镁，或锰，但被锌扰乱。（A）圆二色性（CD）PRL-3在有或无指示金属的情况下的光谱盐，125μM EDTA用作阴性对照。（B）原始使用BeStSel（Beta结构选择）解释CD数据评估PRL-3在α-螺旋、β-表中所占百分比的平台，治疗后出现转向或其他/无序的二级结构状态使用指定的金属盐或EDTA。

图4
钙、镁和锰不会影响PRL-3的稳定性，但锌具有不稳定作用。这个T型_米PRL-3（50%蛋白质展开的温度）在存在或不存在的非还原和还原条件下指示的金属盐。误差条表示标准偏差。使用普通单向阀将条件与对照进行比较方差分析****第页<0.0001，比较治疗含氯化锌₂控件并比较下的控件两种氧化还原状态。

图5
PRL-3对合成物的酶活性基底DiFMUP可以使用Triton-X和TCEP最大化。（A）平均相对荧光单位（RFU）值随时间的变化与指示浓度在标准分析缓冲液。（B）向标准分析中添加0.01%Triton-X与对照组相比，缓冲液提高了0.5μM PRL-3的磷酸酶活性至标准分析缓冲液（对照）和其他拥挤剂，或洗涤剂。（C）三（2-羧乙基）指示浓度测试了膦（TCEP）作为二硫苏糖醇（DTT）的替代物在标准分析缓冲液（0 mM TCEP）中保持PRL-3减少，活动状态。（D）通过以下方法产生的平均RFU值的比较超过DiFMUP 0.5μM PRL-3的时间，在标准值之间含0.01%Triton-X的缓冲液和“优化”缓冲液和5 mM TCEP。

图6
二价金属不会特别影响酶促活动PRL-3。脱磷过程中产生的DiFMU的平均量在25°C（A）下，通过PRL-3在一个小时内对DiFMUP进行检测，以及37°C（B），含低浓度金属盐或EDTA。（C，D） DiFMUP去磷酸化产生的DiFMU的平均量PRL-3在25°C（C）和37°C下持续一小时（D）使用高浓度金属盐或EDTA。

图7
二价金属不会改变PRL-3磷酸半胱氨酸中间体。（A）培养重组PRL-3在指定的时间段内使用DiFMUP和金属盐。这个然后使用Phos-Tag丙烯酰胺和凝胶电泳对样品进行分析从磷酸半胱氨酸中分离非磷酸化PRL-3（底部带）中间形式（顶部带）。半胱氨酸磷酸化是敏感的沸腾，如最后一条车道所示。（B）乐队量化每种条件以估计PRL-3的百分比磷酸半胱氨酸中间态归一化为非DiFMUP控制车道1。

图8
钙、镁、，锰对能力没有影响PRL-3结合CBS结构域，而锌破坏了相互作用。（A）实验对照显示兔IgG同型对照孵育用PRL-3不免疫沉淀蛋白，并验证纯化PRL-3和HA-CBS的抗体敏感性。（B）PRL-3与金属盐或EDTA孵育后再与磁珠负载纯化的HA-CBS蛋白。The ability ofWestern blot分析PRL-3与CBS结构域的结合。

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