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.2023年1月3日；14(1):3.
doi:10.1038/s41419-022-05535-9。

NF-κB/RelA控制的A20限制TRAIL诱导的胰腺癌细胞凋亡

克劳迪娅·盖斯曼 # 1, 夏洛特·豪泽 # 2, 弗劳克·格罗曼 1, 克里斯蒂安·施奈维斯 三, 尼科·博尔特 三, Jan-Paul Gundlach公司 2, Günter Schneider公司 4, 克里斯托夫·罗肯 5, 克里斯蒂安·迈恩哈特 6, 海纳·施费尔 7, 斯特凡·施赖伯 1, 亚历山大·阿尔特 8
附属公司

NF-κB/RelA控制的A20限制TRAIL诱导的胰腺癌细胞凋亡

克劳迪娅·盖斯曼等。 细胞死亡病. .

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）对系统治疗产生耐药性仍然是临床实践中的主要障碍。在这一背景下，NF-κB的组成性和诱导性活性都被认为是关键因素。为了鉴定差异表达和TRAIL耐药介导的NF-κB靶基因，通过转录组分析TRAIL敏感和耐药PDAC细胞系。在这种情况下，A20被鉴定为NF-κB/RelA诱导的靶基因。转化PDAC组织分析证实了PDAC患者中A20蛋白表达升高与RelA表达活化的相关性。在体外实验中，A20表达升高伴随着对TRAIL介导的凋亡的特异性抵抗，但对化疗诱导的细胞死亡没有特异性抵抗。这种TRAIL抗性归因于A20的E3-气体活性介导的锌指结构域。此外，泛素结合支架蛋白p62被确定为受A20影响的TRAIL介导的凋亡诱导途径中不可或缺的蛋白。本研究结果确定A20可能是影响TRAIL诱导PDAC细胞凋亡抵抗的治疗靶点。

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数字

图1
图1。A20是TRAIL耐药PDAC细胞中TRAIL诱导的靶基因。
A类用TRAIL处理细胞6 用westernblot分析h和全细胞裂解物中的抗体。HSP90被用作负荷控制。n个 = 5B类用10 ng/ml TRAIL（5） h.描述的是HALLMARK签名TNFA SIGNALING VIA NF-κB，包括q值。（C） + D） PDAC细胞未经处理C类或转染RelA-特异性siRNAD类用于48 h.然后，按照B类并进行全基因组测序。描述了在Panc1和MiaPaca2细胞中全基因组表达阵列中TRAIL诱导的前10个差异基因，按倍数变化排列。
图2
图2。依赖RelA的A20表达与PDAC细胞的化疗耐药相关。
A类Panc1、Patu8988t、PaTu8902和MiaPaca2细胞未经治疗或在指定时间内接受TRAIL治疗。将分离的总RNA进行逆转录，并通过实时PCR测定A20 mRNA。采用外部标准曲线。A20 mRNA表达与RPL13基因表达相关。描述了重复±S.D.进行的5个独立实验的平均值*P（P）-值<0.05。B类用TRAIL处理细胞6 用指示的抗体分析h和全细胞裂解物。HSP90被用作负荷控制，n个 = 5.（C + D） 耐药PDAC细胞用指示的siRNAs处理，不处理或用TRAIL处理3次 h或5 小时C类或6 小时D类.C类对分离的总RNA进行逆转录，并通过实时PCR分析A20 mRNA的表达，并将其标准化为管家基因的表达。所示为重复进行的5个独立实验的平均值 ± 标准偏差*P（P）-值 < 0.05.D类用所示抗体和β-肌动蛋白作为负荷对照，对总裂解物进行western blot分析，n个 = 5
图3
图3。在PDAC组织中，RelA和A20的表达升高。
A类从31例PDAC组织和相应的正常组织中分离总RNA，进行逆转录，并用qPCR分析A20的表达。对于正常化，分析RPL13的表达。显示肿瘤和正常组织的mRNA表达以及各自的平均值 ± 标准偏差*P（P）-值<0.02。B类描述的是表达式得分（ES = 22例PDAC和8例正常组织中A20和磷酸化-RelA染色的P*S） ± 扫描电镜*P（P）-值 < 0.05.C类A20、磷酸化p65和IgG对照免疫组化染色的代表性图像（比例尺 = 100 nm）显示两个PDAC和一个正常胰腺的组织。D类描述了PDAC组织A20和磷酸化-RelA表达评分（ES）的皮尔逊相关系数和线性回归(n个 = 22).P（P）-指示值。E类GSEA标记分析TCGA和ICGC数据中A20（TNFAIP3）高表达和低表达PDAC的结果。
图4
图4。NF-κB/RelA与A20启动子结合。
A类包含两个κB元素的A20 5′侧翼区域序列（方框中突出显示；#1 NF-κB位点：−45至−54（GGAATCCC）和#2 NF-κ的B位点：–57至−66（GGAAAGTCCC））。下划线为灰色的EMSA寡核苷酸，ChIP引物标记为绿色。B类用TRAIL处理Panc1或PaTu8902细胞指定时间。用跨越一个假定κB结合位点的寡核苷酸进行EMSA分析，n个 = 2C类对于竞争性EMSA分析，除了显示的32带有非标记#1/#2 NF-κB寡核苷酸的P标记NF-κ的B探针、一个一致的NF-κ子B探针或两个不相关的探针（Oct1和AP1），n个 = 2D类对于Panc1核提取物的超位移实验，表明使用了抗体，n个 = 2E类用TRAIL处理Panc1细胞3 使用IgG、RelA或Rpb1抗体沉淀，通过ChIP分析检测裂解产物。将跨越κB位点和结果的引物归一化为输入。平均值 ± 显示了4个独立实验的SD*对 < 0.02之间。
图5
图5。A20介导PDAC细胞对TRAIL的耐药性。
用治疗药物（20 µg/ml依托泊甙，10 µg/ml吉西他滨，或100 ng/ml TRAIL）持续所指示的时间。A类,B类用所示抗体和HSP90和β-肌动蛋白作为负荷对照，对全细胞裂解物进行western blot分析，n个 = 5C类通过subG1分析Panc1细胞（左侧）和Patu8988t细胞（右侧）的凋亡细胞死亡。显示了5个独立实验的结果*对 < 0.05,n个 = 5
图6
图6。A20的Znf4结构域可用于化疗耐药介导。
用显示的A20表达质粒转染Patu A20cc细胞，用TRAIL处理24小时 h、 并通过subG1分析。绘制的是5个独立实验的平均值±S.D。
图7
图7。p62是TRAIL介导的凋亡诱导所必需的。
A类,C类Panc1和B类,D类用对照、A20、p62或A20转染PaTu8902细胞 + p62 siRNA并用TRAIL处理0 h、 4个 h、 或6 小时。A类,B类caspase 3/7检测重复进行，并归一化为mg蛋白。描述的是平均值 ± SD来自5个独立实验。C类,D类用所示抗体和HSP90作为负荷对照，通过western blot实验分析全细胞裂解物，n个 = 5E类,F类用对照或p62 siRNA转染MiaPaca2细胞，然后用TRAIL处理指定时间。E类测定caspase3/7活性，并将其归一化为mg蛋白。F类细胞用乙醇固定并用subG1分析。被描述为手段 ± 来自5个独立实验的SD。G公司高（>75第个百分位数）和低（<25第个百分位）A20 mRNA表达根据其p62 mRNA表达进行细分（高（>75第个百分位数），低（<25第个百分位数）。基于精心策划的ICGC数据集的临床数据(n个 = 81）中）。
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