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.2022年12月24日；4（1）：e198。
doi:10.1002/mco2.198。 eCollection 2023年2月。

通过单细胞转录组学分析在成人皱襞部鉴定出SOX2阳性视网膜干细胞

王晓堂 1 2 三 4, 魏凡 1 2 三 4, 徐宗仁 1 2 三 4, 张琪（音译） 1 2 三 4, 李娜（Na Li） 5, 李若南 1 2 三 4, 王国庆 1 2 三 4, 何思远 1 2 三 4, 李婉倩 1 2 三 4, 廖丹（Dan Liao） 1 2 三 4, Zhi Zhang先生 1 2 三 4, 楠树 1 2 三 4, 嘉兴黄 1 2 三 4, 赵晨阳 1 2 三 4, 侯升平 1 2 三 4
附属公司

通过单细胞转录组学分析在成人皱襞部鉴定出SOX2阳性视网膜干细胞

王晓堂等。 MedComm（2020年）. .

摘要

干细胞治疗是一种很有前途的策略，可以挽救视网膜变性引起的视力损害。先前的研究提出了关于成人眼组织中是否存在原位视网膜干细胞（RSCs）的有争议的理论。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为揭示组织细胞异质性的最有力工具之一。通过使用scRNA-seq，我们研究了成年人眼不同亚区的细胞异质性，包括皱襞部、扁平部、视网膜色素上皮（RPE）、虹膜和神经视网膜（NR）。我们鉴定了一个表达SRY-box转录因子2（SOX2）的亚群为RSC，该亚群存在于成年人眼的皱襞部。进一步分析表明，所鉴定的RSC亚群表达特异性标记水通道蛋白1（AQP1）和四spanin 12（TSPAN12）。因此，我们使用这两种标记物通过流式分选分离出这一亚群，发现分离出的RSC可以增殖并分化为一些视网膜细胞类型，包括感光细胞、神经元、RPE细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、水平细胞、双极细胞和神经节细胞；而AQP1-TSPAN12公司-细胞没有这种分化潜能。总之，我们的结果表明，SOX2阳性RSC存在于皱襞部，由于其增殖和分化潜能，可能对治疗人类视网膜疾病有价值。

关键词：SOX2+AQP1+TSPAN12+；视网膜变性；视网膜干细胞；scRNA‐序列。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1
从健康人眼组织的五个区域分离细胞进行单细胞RNA（scRNA）序列测定的工作流程（用Adobe Illustrator绘制）
图2
图2
单细胞分析揭示了五种组织（皱襞部、扁平部、视网膜色素上皮[RPE]、虹膜和神经视网膜[NR]）中的细胞异质性。（A）t吨‐分布式随机邻居嵌入(t吨‐SNE）图显示褶皱部分的异质性。（B） 褶皱部分样本PALMD在t-SNE图中的表达分布。（C） 皱襞标本t‐SNE图中SOX2的表达分布。（D） t‐SNE图显示了平面部分的异质性。（E） 平坦部样本t‐SNE图中PALMD的表达分布。（F） SOX2在扁平部样本t‐SNE图中的表达分布。（G） t-SNE图显示了RPE的异质性。（H） RPE65在RPE样本t‐SNE图中的表达分布。（一） RPE样本的t‐SNE图中SOX2的表达分布。（J） t-SNE图显示了虹膜的异质性。（K）ITGB1在虹膜样本的t-SNE曲线中的表达分布。（五十） SOX2在虹膜样本t‐SNE图中的表达分布。（M） t-SNE图显示了NR的异质性。PALMD在NR样品的t-SNE曲线中的表达分布。（O） 天然橡胶样品t‐SNE图中SOX2的表达分布
图3
图3
已鉴定视网膜干细胞（RSC）簇的功能分析。（A） 显示褶皱部12个簇之间基因表达差异的热图。（B） 褶皱襞部簇4差异表达基因的KEGG和GO通路富集分析。（C–E）显示与眼睛发育、增殖和分化相关的标记基因表达的小提琴图
图4
图4
荧光激活细胞分选（FACS）通过褶皱样品中特异和差异表达的标记基因对干细胞进行分选。（A） 水通道蛋白1（AQP1）和四spanin 12（TSPAN12）的表达模式。红色表示AQP1的高表达水平，绿色表示TSPAN12的高表达，黄色表示混合高表达水平。（B） 小提琴图显示褶皱襞样品的AQP1、TSPAN12和SOX2标记基因。（C） AQP1、TSPAN12和SOX2的平均表达投影在t分布随机邻域嵌入上(t吨‐SNE）图，以确定干细胞群体。橙色表示最大基因表达，而蓝色表示对数归一化UMI计数中特定基因组的低表达或无表达。（D） FACS分拣后的干度验证工作流程（使用Adobe Illustrator绘制）
图5
图5
验证褶皱部SOX2阳性细胞的增殖潜力。（A） 从皱襞部分离的水通道蛋白1（AQP1）和四spanin 12（TSPAN12）双阴性细胞的SOX2和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）免疫荧光。（B） 褶皱部切片中SOX2的原位免疫染色。橙色方框表示皱襞部的SOX2阳性细胞。该示意图由Adobe Illustrator绘制。（C） 悬浮培养7天后褶皱部中AQP1和TSPAN12双阴性/阳性细胞的SOX2和DAPI免疫荧光。（D） 悬浮培养7天后观察AQP1和TSPAN12双阴性/阳性细胞。黑色虚线框表示悬浮在球体中的双阳性细胞。黑色箭头表示不能悬浮在球体中的双阴性细胞。（E） 通过双标记免疫荧光对Nestin/β-Tubulin III和Nestin/Pax2进行定殖。（F） 褶皱部中分离的SOX2阳性细胞的增殖能力能够长期自我更新，如分选的AQP1和TSPAN12双阳性细胞的单层传代所证明的那样。每条线代表三只不同供眼SOX2阳性视网膜干细胞（RSC）的扩增。标尺：10μm（A、C和D），标尺：50μm（B、E）
图6
图6
多电位验证。在分化培养基中培养3周后，通过不同细胞标记物的免疫荧光染色检测分离细胞的分化能力。所有细胞的细胞核均用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。（A） 视网膜色素上皮（RPE）细胞（RPE65+). （B‐C）感光细胞（Rho+，编号+). （D） 小胶质细胞（IBA1+). （E） 星形胶质细胞（GFAP+). （F） 水平细胞（Calbindin+). （G） 神经元（NeuN+). （H） 双极细胞（PKC-α+). （一） 神经节细胞（NF-M+). 比例尺：10μm（A–E）；25微米（F–I）
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