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.2022年12月28日；12(1):22474.
doi:10.1038/s41598-022-26337-1。

糖尿病细胞中TSP2-Rac1-WAVE2轴的失调导致细胞骨架紊乱、细胞僵硬增加和功能障碍

郝星 1 2, 黄亚庆 三 2, Britta H Kunkemoeller女士 三 2, 彼得·达尔 4 5, Ohvia Muraleetharan先生 1, 尼基尔·马尔万卡 4 5, 迈克尔·默雷尔 1 6 7, Themis R Kyriakides公司 8 9 10
附属公司

糖尿病细胞中TSP2-Rac1-WAVE2轴的失调导致细胞骨架紊乱、细胞僵硬增加和功能障碍

郝星等。 科学代表. .

勘误表in

摘要

成纤维细胞是创伤愈合过程中起关键作用的主要细胞群。作为对损伤的反应，它们增殖并迁移到伤口空间，参与细胞外基质（ECM）的生成、重塑和收缩。然而，关于成纤维细胞功能在糖尿病中如何改变的知识有限。为了解决这一差距，采用了几种最先进的显微镜技术来研究形态、迁移、ECM生成、2D牵引、3D收缩和细胞刚度。对细胞衍生基质（CDM）的分析表明，糖尿病成纤维细胞产生增厚且多孔性较小的ECM，阻碍正常成纤维细胞的迁移。此外，发现糖尿病成纤维细胞失去纺锤形，迁移较慢，产生的牵引力较小，3D收缩力有限，细胞硬度增加。这些变化的部分原因是活性Rac1水平降低以及F-actin和Waskott-Aldrich综合征蛋白家族verprolin同源蛋白2（WAVE2）之间缺乏共同定位。有趣的是，糖尿病成纤维细胞中血小板反应蛋白-2（TSP2）的缺失挽救了这些表型，并恢复了活性Rac1和WAVE2-F-actin共同定位的正常水平。这些结果提供了糖尿病成纤维细胞功能障碍程度的全面观点，突出了TSP2-Rac1-WAVE2-actin轴的调节作用，并描述了TSP2在调节细胞骨架组织中的新功能。

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数字

图1
图1
DB原代皮肤成纤维细胞呈圆形形态。(一)WT、DB和DKO真皮成纤维细胞F-actin（罗丹明-指骨样蛋白）染色的共焦图像显示了细胞形状的差异。比例尺为20μm。(b条)细胞面积、周长、圆形度和总F-actin信号的量化显示，与WT和DKO细胞相比，DB真皮成纤维细胞的形态是圆形的，同时肌动蛋白表达水平保持相似。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 = 每只动物30只）*第页<0.05. (c（c）)与WT和DKO相比，覆盖纤维方向的F-actin代表性灰度图像显示DB细胞中定向F-actin束较少。比例尺为40μm。d日三组纤维方向性的代表性直方图。F-actin方向性角的测量显示DB真皮成纤维细胞的方向性角较低。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 = 每只动物20只）**第页<0.01，*p<0.05. – 表示平均值，--表示第25和75个百分位。
图2
图2
来自糖尿病成纤维细胞的细胞衍生ECM具有阻碍成纤维细胞迁移的增厚的原纤维和较低的孔隙率。(一)来自WT、DB和DKO成纤维细胞的ECM IF图像显示ECM蛋白（I型胶原、VI型胶原和纤维连接蛋白）组织。Arrow强调了来源于糖尿病成纤维细胞的ECM中富含纤连蛋白的基质。比例尺为40μm。(b条)ECM的典型扫描电子图像在显微镜下显示纤维增厚。比例尺为1μm。(c（c）)左，纤维直径的测量显示糖尿病ECM中的纤维大小增加。通过平均沿着纤维（n）的5个随机位置的直径来收集数据动物 = 每组3个，n原纤维 = 每只动物30只）。中间，与DB ECM相比，DKO ECM中纤维曲率的测量显示曲率增加（n动物 = 每个基因型3个，n原纤维 = 每只动物60只）。误差条是指平均值的标准误差。对，孔径测量表明DB ECM（n动物 = 每个基因型3个，n气孔 = 每只动物60只）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验****第页<0.0001，*p<0.05. (d日)左侧，8小时后跨孔底部区域的代表性图像显示，使用DB ECM组的迁移细胞较少。细胞被染成紫色。比例尺 = 100微米。没错，与WT和DKO ECM相比，8小时后通过DB ECM迁移的细胞数量更少。通过平均每个样本（n动物 ≥ 每组4个）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验***第页<0.001，**p<0.01.
图3
图3
糖尿病成纤维细胞对2D和3D胶原基质产生的作用力较小(一)将WT、DB和DKO成纤维细胞接种在12 kPa聚丙烯酰胺凝胶上，其顶部代表性向量场显示了潜在的珠移位。底部，相应的牵引力热图显示了应力的大小和分布。比例尺 = 40微米。(b条)左图显示，各组总应变能的测量结果表明DB电池中缺乏应变能。中间，细胞面积测量显示各组之间没有差异。对，应变能量密度测量显示DB成纤维细胞每单位面积缺乏力产生（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 ≥ 每只动物20只）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验**第页<0.01，*p<0.05. (c（c）)72小时以上三维胶原凝胶收缩的典型图像显示DB成纤维细胞的三维收缩受损。(d日)与DB成纤维细胞相比，72小时后测量的收缩率显示WT和DKO之间的收缩显著。通过将凝胶尺寸除以起始尺寸来计算收缩率。通过每组平均3粒凝胶（n动物 ≥ 每个基因型4个）。使用混合效应模型进行双向方差分析，并进行盖瑟温室校正，然后进行Sidak的多重比较检验*第页<0.05.
图4
图4
糖尿病成纤维细胞迁移受损，僵硬增加。(一)跨孔迁移实验的典型IM图像显示24小时后DB成纤维细胞迁移较少。细胞被染成紫色。比例尺 = 200微米。(b条)每个高倍镜（HPF 20X目标）的细胞数显示DB成纤维细胞迁移较少。通过平均3个HPF（n动物 = 每个基因型3个）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验***第页<0.001之间。(c（c）)该示意图（使用BioRender.com创建）显示了使用球形尖端的AFM测试。图像不符合比例。(d日)典型的力曲线显示压痕过程中的差异。(e（电子）)根据赫兹模型计算的表观弹性模量表明DB成纤维细胞的刚度增加。通过平均每个细胞的5条力曲线（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 ≥ 每只动物6只）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验****第页<0.0001. **第页<0.01.
图5
图5
糖尿病成纤维细胞的功能障碍与缺乏活性Rac1和WAVE2有关。(一)顶部，Rac1和F-actin的代表性IF图像显示Rac1相对于F-actin定位。比例尺 = 40微米。GTP-结合Rac1和总Rac1的中间、代表性western印迹显示DB成纤维细胞中缺乏活性Rac1。补充图4中提供了完整的螺栓。底部，密度分析显示，当归一化为总Rac1信号（n）时，DB中的活性Rac1显著减少动物 = 每组3个）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验*第页<0.05. (b条)皮肤成纤维细胞WAVE2和F-actin染色的典型IF图像显示WAVE2信号和F-action的共同定位。比例尺 = 40微米。(c（c）)WAVE2信号和F-actin信号之间R评分的量化显示了三种基因型之间的差异（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 = 每只动物10只）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验****第页<0.0001. (d日)对皮肤成纤维细胞的典型IF图像进行F-actin染色。比例尺 = 40微米。(e（电子）)测量跛足宽度显示糖尿病成纤维细胞的宽度减小。通过平均每个细胞内的跛足宽度（n动物 = 每个基因型3个，n细胞 = 每只动物10只）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验和多重比较检验****第页<0.0001.
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