Tumour necrosis factor alpha, interleukin 1 beta and interferon gamma have detrimental effects on equine tenocytes that cannot be rescued by IL-1RA or mesenchymal stromal cell-derived factors

doi:10.1007/s00441-022-03726-6

.2023年3月；391(3):523-544.

doi:10.1007/s00441-022-03726-6。 Epub 2022年12月22日。

肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和干扰素γ对马腱细胞有不利影响，而IL-1RA或间充质基质细胞衍生因子无法挽救马腱细胞

艾米丽·史密斯¹, 罗斯·E·博蒙特², 艾丽斯·麦克莱伦^三, 谢丽尔·斯泽^三, 埃斯特·帕洛米诺·拉戈², 自由·黑泽尔格罗夫^2 4, 杰耶什·杜迪亚², 罗杰·K·W·史密斯², Deborah J嘉宾⁵

附属公司

¹英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。ejsmith@rvc.ac.uk。
²英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。
^三英国萨福克新市场动物健康信托预防医学中心，CB8 7UU。
⁴金斯敦大学，River House，53-57 High Street，Kingston on Thames，Surrey，KT1 1LQ，英国。
⁵英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。djguest@rvc.ac.uk。

PMID： 36543895
预防性维修识别码：项目经理C9974687
内政部： 2007年10月10日/00441-022-03726-6

肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和干扰素γ对马腱细胞有不利影响，而IL-1RA或间充质基质细胞衍生因子无法挽救马腱细胞

艾米丽·史密斯等。细胞组织研究. 2023年3月.

.2023年3月；391(3):523-544.

doi:10.1007/s00441-022-03726-6。 Epub 2022年12月22日。

作者

附属公司

¹英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。ejsmith@rvc.ac.uk。
²英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。
^三英国萨福克新市场动物健康信托预防医学中心，CB8 7UU。
⁴金斯敦大学，River House，53-57 High Street，Kingston on Thames，Surrey，KT1 1LQ，英国。
⁵英国皇家兽医学院临床科学与服务系，地址：Hawkshead Lane，North Mymms，Hatfield，Herts，AL9 7TA，UK。djguest@rvc.ac.uk。

PMID： 36543895
预防性维修识别码：项目经理C9974687
内政部： 2007年10月10日/00441-022-03726-6

摘要

肌腱损伤在人和马运动员中都很常见，肌腱再生不良会导致功能性瘢痕组织缺陷和再损伤频率增加。尽管有证据表明，炎症解决不足会导致纤维化愈合，但我们对与腱病相关的炎症途径的理解仍然很差，这意味着缺乏成功的靶向治疗。在这里，我们证明IL-1β、TNFα和IFN-γ协同工作，对马腱细胞产生比单独使用时更大的有害后果。这包括改变肌腱相关和基质金属蛋白酶基因的表达，损害细胞收缩三维胶原凝胶的能力，这是一种更接近体内环境的培养技术。此外，使用IL-1RA或BM-MSCs产生的因子直接抑制IL-1β无法挽救这些不良反应。此外，我们提供证据表明，NF-κB（而不是JNK、P38 MAPK或STAT 1）在TNFα和IL-1β刺激后转位到细胞核并能够与腱细胞中的DNA结合，这表明这种信号级联可能是这些炎性细胞因子的不利下游后果的原因。因此，我们建议针对NF-κB等特定信号通路，可能是治疗肌腱病的最佳方法。

关键词：细胞因子；马；炎症；间充质干/基质细胞；肌腱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
概述细胞因子优化的实验研究设计(一)，炎症途径激活(b条)炎症细胞因子对马腱细胞的影响(c)IL-6对马腱细胞的影响(d日)和BM-MSC或IL-1RA救援(**e（电子）**). 使用BioRender.com创建

图2
NF-κB P65在炎症细胞因子刺激下的定位和DNA结合。(一–一“”“）IL-1β、TNFα和/或IFN-γ刺激1h后肌腱细胞NF-κB P65的免疫荧光染色。细胞核的DAPI染色显示为蓝色。图像代表了三种生物复制。比例尺 = 50微米。(b条)细胞因子刺激1小时后NF-κB P65免疫荧光相对核荧光强度的量化。数据显示，与无细胞因子对照组相比，折叠变化。误差条表示三个生物复制品中每一个的三个测量值的S.E.M。星号表明核荧光强度的倍数变化与无细胞因子对照和IFN-γ显著不同(第页 < 0.05). 数字符号表示不同条件下核荧光强度的折叠变化有显著差异(第页 < 0.05). (c)细胞因子刺激1小时后的NF-κB P65 DNA结合ELISA。将用所有三种细胞因子刺激的肌腱细胞的一个生物复制品与野生型共有寡核苷酸（DNA结合的竞争对手）和突变的共有寡核苷酸（对DNA结合没有影响）相结合也显示出了结果。误差条代表三个生物复制品的S.E.M。这些实验中的细胞在P3和P10之间

图3
炎症细胞因子刺激引起的其他炎症途径的定位和激活。STAT1的免疫荧光染色(一–一“”），JNK(b条–b条“”）和P38 MAPK(c–cIL-1β、TNFα和/或IFN-γ刺激后肌腱细胞中的“”）。c’’’’显示马诱导的多能干细胞染色，并作为阳性对照。细胞核的DAPI染色显示为蓝色。所有图像都代表了三种生物复制。比例尺 = 50微米。STAT1相对核荧光强度的量化(d日)和JNK(**e（电子）**)还显示了以下细胞因子刺激。数据显示，与无细胞因子对照组相比，折叠变化。误差条表示三个生物复制品中每一个的三个测量值的S.E.M。星号表示核荧光强度的折叠变化与无细胞因子控制显著不同(第页 < 0.05). 这些实验中的细胞在P4和P8之间

图4
炎症刺激对肌腱细胞三维胶原凝胶收缩的影响。(一)与单独使用时相比，联合使用的炎症细胞因子可在更大程度上减少腱细胞对胶原凝胶的收缩。星号表示胶原蛋白凝胶收缩的程度与无细胞因子控制显著不同(第页 < 0.05). 数字符号表明胶原蛋白凝胶收缩的程度与所有3种细胞因子的组合显著不同(第页 < 0.05). (b条)IFN-γ增强TNFα和IL-1β对肌腱细胞三维胶原凝胶收缩的影响。数字符号表示胶原蛋白凝胶收缩的程度在指定条件下有显著差异第页 < 0.05. 所有误差条代表肌腱细胞四个独立生物复制品的S.E.M。第14天三维胶原凝胶收缩的代表性图像如c–c’’’’''所示。比例尺 = 5毫米。这些实验中的细胞在P4和P10之间

图5
炎性细胞因子改变肌腱细胞中的基因表达。肌腱相关的折叠变化(一)和*基质金属蛋白酶*(b条)与无细胞因子对照组相比，IFN-γ、TNFα和/或IL-1β刺激后腱细胞的基因表达。星号表示与无细胞因子控制相比存在显著差异第页 < 0.05. 数字符号表示所示细胞因子条件之间存在显著差异(第页 < 0.05). 误差条代表三个生物复制品的S.E.M。这些实验中的细胞在P4和P8之间

图6
IL-6不能激活NF-κB信号，对三维胶原凝胶收缩或肌腱细胞的基因表达没有影响。(一)IL-1β和所有三种细胞因子联合使用显著增加肌腱细胞的IL-6分泌，但单独使用TNFα或IFN-γ不明显。(b条–b条“”）IL-6刺激1h后肌腱细胞NF-κB P65的免疫荧光染色。细胞核的DAPI染色显示为蓝色。图像代表了三种生物复制。比例尺 = 50微米。(c)IL-6对肌腱细胞的三维胶原凝胶收缩没有影响。显示了第14天凝胶收缩的典型图像(c’–c’’). 比例尺 = 5毫米。(d日)IL-6和无细胞因子对照凝胶在细胞存活方面没有发现显著差异。肌腱相关的折叠变化(**e（电子）**)和*基质金属蛋白酶*(**（f）**)与无细胞因子对照组相比，IL-6刺激后腱细胞的基因表达。每个实验使用三个生物复制品进行。星号表示与无细胞因子对照组相比存在显著差异(第页 < 0.05). 误差条代表三个生物复制品的S.E.M。这些实验中的细胞介于P2和P9之间

图7
当IL-1β、TNFα和IFN-γ联合刺激时，IL-1RA不能保护肌腱细胞。(一)IL-1RA（RA）能够单独阻断IL-1β的作用，但不能阻断所有三种细胞因子联合作用对肌腱细胞三维胶原凝胶收缩的影响。星号表示胶原蛋白凝胶收缩的最终程度与无细胞因子控制显著不同(第页 < 0.05). 误差线代表肌腱细胞四个生物复制品的S.E.M。(b条–b条“”“）用或不用IL-1RA刺激IL-1β、TNFα和IFN-γ1小时后，肌腱细胞NF-κB P65的免疫荧光染色。细胞核的DAPI染色显示为蓝色。图像代表了三种生物复制。比例尺 = 50微米。肌腱相关的折叠变化(c)和*基质金属蛋白酶*(d日)与无细胞因子对照组相比，炎症细胞因子和/或IL-1RA刺激后腱细胞的基因表达。数字符号表示救援效果显著(第页 < 0.05). 误差线代表肌腱细胞三个生物复制品的S.E.M。这些实验中的细胞在P4和P10之间

图8
骨髓基质干细胞不能释放可溶性因子来保护肌腱细胞免受复合炎症刺激。免疫荧光显示BM-MSC条件培养基(一“”）也不是共培养中的BM-MSC(一“”）能够防止细胞因子刺激后肌腱细胞中NF-κB P65的核移位(一–一’’’). 细胞核的DAPI染色显示为蓝色。这些图像代表了肌腱细胞的四种生物复制。比例尺 = 50微米。(b条)细胞因子刺激后NF-κB相对核荧光强度的量化。数据显示为与无细胞因子对照组相比的折叠变化。误差线代表肌腱细胞四个生物复制品的S.E.M。星号表示核荧光强度的折叠变化与无细胞因子控制显著不同(第页 < 0.05). (c–c'）BM-MSC条件培养基或共培养的BM-MSC无法缓解炎症细胞因子对肌腱细胞三维胶原凝胶收缩的不利影响。第14天的代表性胶原凝胶图像(c). 星号表示胶原凝胶收缩的程度与无细胞因子对照组显著不同（右；第页 < 0.05). 肌腱相关的折叠变化(d日)和*基质金属蛋白酶*(d日'）与无细胞因子对照组相比，炎症细胞因子刺激和无BM-MSC、BM-MSC条件培养基或共培养BM-MSC培养后腱细胞中的基因表达。数字符号表示各组之间存在显著差异(第页 < 0.05). 误差线代表肌腱细胞四个生物复制品的S.E.M。这些实验中的细胞在P3和P10之间

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1. Abraham AC、Shah SA、Golman M、Song L、Li X、Kurtaliaj I、Akbar M、Millar NL、Abu-Amer Y、Galatz LM、Thomopoulos S.在慢性肌腱疾病中靶向NF-kB信号通路。《科学与运输医学》2019 doi:10.1126/scitranslmed.aav4319。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Abraham AC、Shah SA、Thomopoulos S.《针对旋转肌袖带肌腱退化和修复中的炎症》。2017年Tech Shoulder肘部手术；18:84–90. doi:10.1097/BTE.00000000000124。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Aggarwal S，Pittenger MF。人类间充质干细胞调节异基因免疫细胞反应。鲜血。2005;105:1815–1822. doi:10.1182/bloud-2004-04-1559。-内政部-公共医学
1. Alfredson H，Lorentzon R。慢性肌腱疼痛：没有化学炎症迹象，但神经递质谷氨酸浓度高。对治疗的影响？当前药物目标。2002;3:43–54. doi:10.2174/1389450023348028。-内政部-公共医学
1. Barsby T，Bavin EP，Guest DJ。三维培养和转化生长因子β3协同促进马胚胎干细胞的成腱分化。组织工程——2014年A部分；20:2604–2613. doi:10.1089/ten.tea.2013.0457。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Abraham AC、Shah SA、Thomopoulos S.《针对旋转肌袖带肌腱退化和修复中的炎症》。2017年Tech Shoulder肘部手术；18:84–90. doi:10.1097/BTE.00000000000124。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Aggarwal S，Pittenger MF。人类间充质干细胞调节异基因免疫细胞反应。鲜血。2005;105:1815–1822. doi:10.1182/bloud-2004-04-1559。-内政部-公共医学

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[7] Alfredson H，Lorentzon R。慢性肌腱疼痛：没有化学炎症迹象，但神经递质谷氨酸浓度高。对治疗的影响？当前药物目标。2002;3:43–54. doi:10.2174/1389450023348028。-内政部-公共医学

[8] Alfredson H，Lorentzon R。慢性肌腱疼痛：没有化学炎症迹象，但神经递质谷氨酸浓度高。对治疗的影响？当前药物目标。2002;3:43–54. doi:10.2174/1389450023348028。-内政部-公共医学

[9] Barsby T，Bavin EP，Guest DJ。三维培养和转化生长因子β3协同促进马胚胎干细胞的成腱分化。组织工程——2014年A部分；20:2604–2613. doi:10.1089/ten.tea.2013.0457。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Barsby T，Bavin EP，Guest DJ。三维培养和转化生长因子β3协同促进马胚胎干细胞的成腱分化。组织工程——2014年A部分；20:2604–2613. doi:10.1089/ten.tea.2013.0457。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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