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.2022年11月30日；6（2）：e202201372。
doi:10.26508/lsa.202201372。 打印2023年2月。

重温人类AURKA中APC/C靶向所需的degron基序FZR1公司

艾哈迈德·阿卜杜勒巴基 1, 卡米拉·阿斯卡内利 1, 辛西娅·奥科耶 1, H贝格姆·阿克曼 1, 贾科莫·詹森 2, Mingwei Min女士 1, 奇亚拉·马可齐 1, Anja Hagting公司 1, 里斯格兰特 1, 玛丽亚·德·卢卡 1, 意大利Anna Asteriti 三, 朱利娅·瓜格利尼 三, 亚历山德罗·帕亚迪尼 2, 凯瑟琳·林登 4
附属公司

重温人类AURKA中APC/C靶向所需的degron基序FZR1公司

艾哈迈德·阿卜杜勒巴基等。 生命科学联盟. .

摘要

有丝分裂激酶Aurora A（AURKA）在其多个活性构象上与其他激酶不同，这可能解释了其间期作用和靶向激酶囊的药物的有限疗效。细胞对AURKA活性的调节在很大程度上依赖于后发复合体（APC/C）介导的破坏FZR1公司)在有丝分裂退出和G1期，除了在C末端报道的典型D盒去电子外，还需要在AURKA中有一个非典型的N末端去电子，称为“A盒”。在这里，我们发现所报道的AURKA的C末端D-box并不是一个degron，而是介导蛋白质的基本结构特征。在活细胞中，含有A盒的AURKA的N末端固有无序区域足以导致FZR1依赖性有丝分裂降解。在电子和细胞分析中，预测A盒的QRVL短线性相互作用基序为磷酸调节的D盒。我们认为，全长AURKA的降解也依赖于完整的C末端结构域，因为关键的构象参数允许AURQA的活性和有丝分裂降解。

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数字

图1。
图1..C端子R371AURKA的xxL基序在折叠和功能中起着关键作用。
（A、B）在C端子D盒样图案的电子测试中。（A）AURKA C端区域（此处，PDB ID:1MQ4）的已发布结构显示R371xxL基序埋藏在激酶域中。精氨酸残基R371（橙色）与保守的谷氨酸残基E299（绿色）建立盐桥。亮氨酸L374适合于激酶结构域上的疏水性脂肪族囊。（A、B）在为R371A和L374A替换建模的预测结构中，（A）中所示的相互作用丢失。使用FoldX3软件预测了蛋白质折叠状态的吉布斯自由能变化（ΔΔG=ΔGmut-ΔGwt），表明R371A和L374A取代比保守取代L374I对结构的不稳定性更强。（C、D、E）人类U2OS细胞中不同版本静脉标记AURKA的特征。（C）显示AURKA-Venus在间期和有丝分裂期间在活细胞中定位的面板。（D）将转染不同AURKA-Venus变体的U2OS细胞进行MeOH固定，并使用抗GFP（红色）、β-微管蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的抗体进行免疫荧光处理。图中显示了有丝分裂细胞的代表性图像（上部面板），随附的图表（下部面板）显示了AURKA变异体纺锤定位的量化数据：在纺锤（靠近但不重叠中心体）和细胞质（纺锤和皮层之间的中间）测量了固定大小ROI内的平均像素值并且，在减去背景值（靠近细胞）后，用于计算纺锤体：细胞质比率。绘制单个有丝分裂细胞（n≥10）的数据，用条形图表示平均值和标准偏差。（E）与isPLA分析的TPX2的相互作用（另见图S1）。isPLA信号揭示了AURKA-Venus–TPX2在有丝分裂纺锤体上的相互作用（上图中的例子），定量数据如附图（下图）所示：每个有丝分裂细胞的总isPLA信息被测量，校正为背景，并归一化为每个实验中WT值的平均值。每种条件（n≥10）的数据都用条形图和晶须绘制在散点图中，以指示平均值和SD。（D、E）通过普通单向方差分析将每个突变与WT进行比较**P（P）≤ 0.01; ***P（P）≤ 0.001; ****P（P）≤ 0.0001; 和n.s.，不重要。结果代表了两次相同的重复实验。
图S1。
图S1.测量AURKA–TPX2相互作用的isPLA实验控制。
U2OS细胞与WT AURKA-Venus共转染，并单独或联合使用小鼠GFP和兔TPX2抗体进行处理，用于检测AURKA-Venus和内源性TPX2的isPLA。图中显示了有丝分裂细胞的示例图像（左侧面板），测量并绘制了isPLA信号（右侧图表）。散点图显示了单个细胞的全细胞测量值，平均值±标准偏差用红色表示****P（P）≤0.0001乘以at吨测试。
图S2。
图S2..根据pT288标记，无法与TPX2相互作用的AURKA-Venus的C末端突变体处于非活性状态。
用WT或不同版本的AURKA-Venus瞬时转染U2OS细胞，AURKA-Venus在假定的C末端D-box或非TPX-结合S155R对照中突变。用免疫印迹法检测有丝分裂阻滞细胞的提取物中的pT288-AURKA。印迹是两个相同实验的代表。
图2。
图2..R371xxL motif不是D-box。
（A、B）AURKA-Venus的细胞有丝分裂降解试验。图中显示了单个细胞有丝分裂退出时荧光延时成像的定量金星水平。单个细胞的Venus水平在后期开始时与Venus标准化，并在电子同步中，以便可以绘制每个版本的AURKA-Venus的平均值和标准偏差。（A）据预测，在有丝分裂退出期间，突变会导致C末端阻断AURKA降解的中断：R371A/L374A（上图，n≥10个细胞，来自两个实验）阻断AURKA-Venus降解的方式与删除n末端a盒（下图，n≥6个细胞，出自一个实验）的方式类似（Floyd等人，2008）。（B）保守取代L374I对AURKA-Venus的降解动力学没有影响（n≥10个细胞，从两个实验中合并）。（C）AURKA-Venus各版本降解百分比与R中取代残基预测ΔΔG的相关图371xxL。（D）AURKA和Plk1中已知和建议的学位示意图。（E）在YFP-Plk1 WT和L341I版本的细胞有丝分裂降解分析中（n≥10个细胞，从两个实验中合并）。R的P4处的L>I替换337xxL基序消除了有丝分裂出口处的降解，同时对蛋白质的定位没有影响（右侧面板）。
图S3。
图S3.降级影片的时间间隔。
图2和图3分析了延时电影的帧。（A、B、C）AURKA-Venus变体（A）和EYFP-Plk1变体（B）显示荧光图像，而AURKA（1-67）-mNeon构造（C）显示DIC和荧光图像组合。相对于后期开始计时，时间以分钟表示。比例尺，10μm。
图S4。
图S4.AURKA（1-133）-GFP在有丝分裂出口处以FZR1敏感性方式降解。
U2OS父级或FZR1击倒对手用GFP标记的全长或1-133AURKA转染细胞，通过有丝分裂拍摄活细胞。GFP荧光在单个细胞中定量，并绘制为相对于后期发病水平的剩余蛋白质部分。曲线显示n≥5个单元格的平均值和标准偏差。结果代表了两个实验，并与图3数据一致。
图3。
图3..Q45AURKA A-box中的RVL图案显示了D-box degron的属性。
（A、B）U2OS或FZR1中表达的全长AURKA-mNeon和AURKA（1-67）-mNeon的细胞有丝分裂降解试验击倒对手U2OS细胞。单个细胞的mNeon水平根据后期发病水平进行标准化，并在电子同步中进行，以便可以绘制每个蛋白质的平均值和标准偏差（n≥20个细胞，来自≥3个实验）。降解曲线表明，（A）残基1-67足以进行有丝分裂出口特异性FZR1依赖性降解，（B）AURKA（1-67）-mNeon的有丝分裂降解依赖于K时的SLiM5和Q45RVL。（C）使用FlexPepDock服务器，通过统计优化的蛋白质-蛋白质对接原子势，对拟议AURKA在FZR1上的已知结合囊中进行电子对接的能量学进行评分。（D）A-box（QRVLCPSNS）肽与H（H）.秒.FZR1 DBR（顶板），根据结构PDB ID:4BH6建模，显示S公司.c（c）.Cdh1与D-盒肽（RIALKD）结合。PDB ID:4BH6显示在底部面板中进行比较（He等人，2013）。（E）在AURKA-Venus WT和L48I的细胞有丝分裂降解分析中（A-box基序P4处L>I，n=26个细胞来自两个实验）。（F）在AURKA（1-67）-mNeon的细胞有丝分裂降解试验中45RVLCPSNS肽（所谓的“A-box”）被替换为真诚地Plk1（R）的D盒337KPLTVLNK）或C端子R371AURKA的PMLREVLE图案。
图S5。
图S5：与其他degron面板相比，A盒图案与DBR站点的电子对接。
与一系列经验证的D-box和KEN降解相对应的肽、AURKA a-box（Q45RVLxxx）和也与共激活剂结合的ABBA基序（均取自Davey&Morgan[2016]）被电子对接到FZR1的DBR裂缝中。结合能表示为统计优化的原子势分数，并显示A盒与DBR和许多D盒对接。
图4。
图4.Q的建模45DBR处的RVL基序解释了AURKA S51磷酸化的作用。
（A）Q的对接45FZR1上的RVLPSNSS肽。通过电子对接预测DBR中QRVL的姿势，显示P4亮氨酸的方向以及P2和P7提供的新接触。（B）AURKA-Venus WT和S51D的细胞有丝分裂降解试验。（C）WT的泛素化和A-box中携带突变的不同版本AURKA；从同步于有丝分裂出口的U2OS细胞中纯化瞬时表达的静脉标记蛋白，并对GFP（绿色）和泛素结合物（FK1抗体，红色）进行印迹。相对泛素化绘制为泛素结合蛋白与未修饰蛋白的比率，与WT蛋白进行标准化；误差条显示了重复三次实验的SDs。（D）使用FoldX3计算WT和S51D肽的自由能值。在电子对接模型中，使用突变肽QRVLCPDNS重建模型，使用FoldX3对模型进行评分，并绘制每个模型的平均结合自由能。根据Mann-Whitney测试，突变体的较高结合能显著(P（P）= 0.0147).
图5。
图5..R371xxL基序在AURKA的构象调控中起着关键作用。
（A）AURKA-Venus WT和S155R的细胞有丝分裂降解试验。单个细胞的Venus水平根据后期发病水平进行标准化，并在电子同步中进行，以便可以绘制每个蛋白质的平均值和标准偏差（n≥10个细胞，代表两个实验）。（B）示意图表明，R371和AURKA降解性之间的联系是由一个构象步骤介导的，该构象步骤同时激活AURKA（导致T288上的磷酸化）并使其可被APC/C降解45RVL基序“埋藏”在WT蛋白（绿色）的自动抑制状态下，一旦释放，就会通过S51上的磷酸化自动调节。R371A突变体（橙色）无法经历活化和降解所需的关键构象步骤。原理图创建于BioRender.com网站.
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