CasPlay provides a gRNA-barcoded CRISPR-based display platform for antibody repertoire profiling

doi:10.1016/j.crmeth.2022.100318

.2022年10月17日；2(10):100318.

doi:10.1016/j.crmeth.2022.100318。 eCollection 2022年10月24日。

CasPlay提供了一个基于gRNA-编码的CRISPR的显示平台，用于抗体库分析

卡尔·W·巴伯^1 2, 埃伦·什洛克^1 2, 斯蒂芬·J·埃尔奇^1 2

附属公司

¹美国马萨诸塞州波士顿霍华德·休斯医学研究所布里格姆女子医院遗传科，邮编02115。
²哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿02115。

PMID： 36313802
预防性维修识别码： PMC9606310型
内政部： 2016年10月10日/j.crmeth.2022.100318

CasPlay提供了一个基于gRNA-编码的CRISPR的显示平台，用于抗体库分析

卡尔·W·巴伯等。单元格代表方法. 2022.

.2022年10月17日；2(10):100318.

doi:10.1016/j.crmeth.2022.100318。 eCollection 2022年10月24日。

作者

卡尔·W·巴伯^1 2, 埃伦·什洛克^1 2, 斯蒂芬·J·埃尔奇^1 2

附属公司

¹美国马萨诸塞州波士顿霍华德·休斯医学研究所布里格姆女子医院遗传科，邮编02115。
²美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院遗传学系，邮编02115。

PMID： 36313802
预防性维修识别码： PMC9606310型
内政部： 2016年10月10日/j.crmeth.2022.100318

摘要

蛋白质显示技术将蛋白质与不同的核酸序列（条形码）联系起来，通过DNA测序实现多重蛋白质分析。在这里，我们开发了Cas9显示（CasPlay），通过对与每个肽相关的引导RNA（gRNA）条形码进行测序，查询与催化活性不活跃的Cas9（dCas9）融合的定制肽库。我们首先通过恢复单克隆抗FLAG抗体的已知结合基序来确认CasPlay表征抗体表位的能力。然后，我们使用CasPlay库平铺严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）蛋白质组来评估疫苗诱导的抗体反应性。使用代表人类病毒组的肽库，我们证明了CasPlay从微升患者血清中识别许多病毒的表位的能力。我们的结果表明，CasPlay是从高度复杂的文库进行定制蛋白质相互作用研究的可行策略，并可能提供噬菌体展示技术的替代方案。

关键词：CRISPR；案例9；抗体结合；生物技术；肽展示；蛋白质显示。

PubMed免责声明

利益冲突声明

K.W.B.和S.J.E.已向美国专利和商标局提交了与此工作相关的专利申请（美国专利申请号63/220399）。S.J.E.是TScan Therapeutics、Maze Therapeunics、ImmuneID和Mirimus的创始人。S.J.E.是同源药物、TScan治疗学、ImmuneID和Maze治疗学的科学顾问委员会成员。

数字

图1
CasPlay库设计和工作流程定制肽库编码在寡核苷酸库中，每个肽序列与一个唯一的20 bp核酸序列配对，用作gRNA条形码。肽表达于E类大肠杆菌作为dCas9的融合物，结合到独特的gRNA条形码序列并在单个批次中纯化。gRNA序列有一个通用的5′恒定区，便于RT-PCR扩增。该文库随后用于使用人类血清抗体的免疫沉淀实验。通过富集的gRNA条形码的核苷酸序列确定与这些抗体结合的肽。

图2
绘制具有单一氨基酸分辨率的抗体表位的CasPlay实验（A）为CasPlay制作了一个FLAG肽（DYKDDDK）饱和突变文库，其中沿着FLAG表位的长度执行每一个可能的单一氨基酸替换，每个变体肽与一个独特的gRNA条形码相关联。（B）基于序列的gRNA条形码富集分析揭示了关键氨基酸位置，以协调M2抗体与FLAG肽表位的结合。4个gRNA条形码复制品和两个独立实验复制品的平均富集数据。（C）通过序列标志（Schneider和Stephens，1990；Tareen和Kinney，2020）确定了抗体结合的DYKxxDxx基序的富集，与之前的研究一致（Layton等人，2019）。（D）通过CasPlay对FLAG变异肽进行序列富集与PICASSO进行了比较，后者是一种基于微阵列的策略，用于研究带有荧光成像读数的定制dCas9-融合肽库（Barber等人，2021年）。

图3
CasPlay（A）对SARS-CoV-2表位进行了定位。CasPlay提出了一个肽库，用于拼接先前研究（Barber等人，2021）中的SARS-CoV-2蛋白质组（不包括ORF1ab）。（B） CasPlay实验使用2020年12月之前采集的8份样本（“前冠肺炎”）、8名新冠肺炎感染后患者（“恢复期”）、接受疫苗前的8名患者以及接受第二剂mRNA疫苗后2周至3个月内的8名相同患者的血清样本进行。通过CasPlay进行的gRNA条形码富集分析揭示了恢复期和接种疫苗的患者样本中患者抗体识别的棘突和/或核衣壳蛋白中的表位区域。浓缩计算为标准化输出gRNA测序读数除以预富集的标准化测序读数，数据在4个gRNA条形码复制和两个独立的实验复制之间取平均值（更多详细信息，请参阅STAR方法）。

图4
CasPlay能够根据先前研究中的肽库，以人类病毒组规模（A）122501百万分位肽为基础，对CasPlay显示的人类病毒组进行抗体查询（Shrock等人，2020年；Xu等人，2015年）。每个肽与一个正交gRNA条形码配对，每个肽分配两个单独的条形码（共245002个库成员）。商业单克隆抗体（如FLAG、HA、myc）识别的表位标签也在文库中编码为对照肽。（B）使用抗FLAG、抗HA和抗myc抗体进行的CasPlay对照实验在整个245002米的文库中鉴定了所有十个相应的对照复制品，没有一个非靶向表位标签肽。误差条显示SD以平均值为中心。（C） CasPlay能够从245002个成员的文库中识别多个患者共同靶向的病毒蛋白亚区（公共表位）。来自腺病毒A、EB病毒和呼吸道合胞病毒的实例。Z轴对两个独立患者样本的gRNA条形码重复项的得分进行平均。

图5
CasPlay与全长蛋白显示和应用兼容（A）合成抗体表达为与dCas9的C末端融合，带有独特的gRNA条形码。识别β-catenin肽的纳米体（Braun等人，2016；Traenkle等人，2015）和识别SARS-CoV-2棘突蛋白的单链抗体（Wang等人，2021）与独特的gRNA配对。（B）将合成抗体的目标抗原吸附到平板表面，然后与dCas9抗体融合物孵育。然后使用gRNA序列特异性引物对与每个抗体相关的gRNA进行RT-PCR，以检测抗体与其靶抗原的结合。（C）琼脂糖凝胶上RT-PCR扩增子的密度测定显示，仅在存在各自分析物的情况下，每个合成抗体的特定保留和检测，表明合成抗体的功能性。n=3个独立的重复用于每个条件。绘制SD平均值。

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