Ectopic expression of sericin enables efficient production of ancient silk with structural changes in silkworm

doi:10.1038/s41467-022-34128-5

.2022年10月22日；13(1):6295.

doi:10.1038/s41467-022-34128-5。

丝胶蛋白的异位表达使家蚕能够通过结构变化高效生产古丝绸

陈学东^#^1 2, 王永丰^#^1 2, 王玉君（Yujun Wang）^#^三, 李秋英^1 2, 梁信银^1 2, 广旺^1 2, 李江兰^1 2, 彭如济^1 2, 杨湖司马^1 2, 徐世清^4 5

附属公司

¹苏州大学苏州医学院生物与基础医学院，苏州，215123，中国。
²苏州大学现代丝绸国家工程实验室，苏州，215123，中国。
^三北部湾大学海洋科学学院北部湾海洋生物多样性保护广西重点实验室，钦州，535011。
⁴苏州大学苏州医学院生物与基础医学院，苏州，215123，中国。szsqxu@suda.edu.cn。
⁵苏州大学现代丝绸国家工程实验室，苏州，215123，中国。szsqxu@suda.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 36273007
预防性维修识别码： PMC9588020型
内政部： 10.1038/s41467-022-34128-5

丝胶蛋白的异位表达使家蚕能够通过结构变化高效生产古丝绸

陈学东等。国家公社. 2022.

.2022年10月22日；13(1):6295.

doi:10.1038/s41467-022-34128-5。

作者

陈学东^#^1 2, 王永丰^#^1 2, 王玉君（Yujun Wang）^#^三, 李秋英^1 2, 梁信银^1 2, 广旺^1 2, 李江兰^1 2, 彭如济^1 2, 杨湖司马^1 2, 徐世清^4 5

附属公司

¹苏州大学苏州医学院生物与基础医学院，苏州，215123，中国。
²苏州大学现代丝绸国家工程实验室，苏州，215123，中国。
^三北部湾大学海洋科学学院北部湾海洋生物多样性保护广西重点实验室，钦州，535011。
⁴苏州大学苏州医学院生物与基础医学院，苏州，215123，中国。szsqxu@suda.edu.cn。
⁵苏州大学现代丝绸国家工程实验室，苏州，215123，中国。szsqxu@suda.edu.cn。

^#贡献均等。

PMID： 36273007
预防性维修识别码： PMC9588020型
内政部： 10.1038/s41467-022-34128-5

摘要

家蚕蚕丝是一种超长天然蛋白纤维，具有独特的结构和优异的性能。创新的高性能丝绸结构需求巨大，从而导致了产业瓶颈。其中，外层丝胶SER3通过猪芽孢杆菌介导的转基因方法在家蚕的后丝腺（PSG）中体外表达，然后分泌到内丝素层，从而产生丝胶微粒体分散在丝素纤维中的纤维。PSG分泌的水溶性SER3蛋白导致P25从Fib-H/Fib-L/P25聚合物的丝素单元分离，并在丝素层和丝胶层之间积聚。因此，丝素胶体在丝腺腔中的水溶性和稳定性以及结晶度都有所提高，茧纤维的机械性能、丝的吸湿性和吸湿性也有所提高。同时，该突变体克服了存活率低和丝腺发育异常的问题，从而提高了茧丝的生产效率。总之，我们描述了一种丝腺转基因靶蛋白选择策略，以改变丝纤维结构并创新其特性。这项工作为生产具有新功能的蚕丝纤维提供了一种高效、绿色的方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。转基因家蚕的构建。**
一SG生产茧丝的示意图。丝原纤维是由PSG合成的Fib-H/Fib-L/P25聚合物丝素单元形成的长链。由PSG细胞合成的丝素重链蛋白（Fib-H）、丝素轻链蛋白（Fib-L）和P25蛋白以丝素单元的形式分泌到腔中，然后以亚稳态高浓度水胶体的形式转移到味精中。在味精管腔中，丝素蛋白的水胶体被丝胶C（丝胶1是主要成分）包围，丝胶C由味精的后端和中部分泌，然后被丝胶B（混合丝胶）和丝胶A（丝胶3是主要组成）包围，由味精中部和前部分泌。b条技术战略。在家蚕PSG细胞中高效转基因表达SER3重组蛋白，以实现分泌到PSG腔中，并将水溶性丝胶蛋白3重组蛋白并入丝素胶溶液中，改变丝素蛋白聚合物的亚稳态，进一步影响自组装后的丝纤维结构。SM，丝胶微粒体在PSG中表达并并入蚕茧丝原纤维。用于在PSG中表达丝胶蛋白3重组基因的转基因突变系统。WT，野生型。**c（c）**转基因piggyBac载体。为了增强PSG细胞丝胶3蛋白（SER3）的表达和分泌重链基因启动子序列与1416 含有信号肽的bp碱基序列被引入丝胶3基因上游(*序号3*)长度为3120的序列 bp（补充序列1）。这个*EGFP公司*报告基因序列与333 bp碱基序列位于重链基因连接在*序号3*基因序列。此外，人工启动子3 × P3，由三个串联组成*PAX-6型*转录因子结合序列，在家蚕眼睛和神经系统中特异表达，用于调节*招标书*报告基因。

**图2。PSG合成的SER3重组蛋白在茧丝中的分布及其对纤维结构的影响。**
观察到的蚕丝纤维图像一荧光显微镜和b条激光共聚焦显微镜。丝纤维中PSG合成SER3重组蛋白的EGFP荧光定位。**c（c）**丝绸纤维纵向截面的透射电子显微照片。由PSG合成的SER3蛋白分散在丝纤维的原纤维中。d日P25蛋白在丝纤维中的免疫荧光定位。图2a至图2d:WT-L和SER-L，丝绸纤维的纵向截面；WT-C和SER-C，蚕丝纤维的横截面；R-生丝；D-蚕丝，脱胶蚕丝。SF，丝素层。SS，丝胶层。丝素原纤维中的丝胶蛋白微粒体。真空，液泡。**e（电子）**采用经典脱胶法测定了蚕丝中的丝胶含量。数据表示为平均值 ± SEM和未配对吨-两组之间的比较采用测试分析。n个 = 3个茧。**（f）**用蛋白质印迹法测定茧丝中SER3蛋白的含量；P25为内部参考。n个 = 3.EGFP定位结果表明，重组SER3蛋白具有单倍体和二聚体2型，二聚体是主要类型。数据表示为平均值 ± 除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。

**图3。PSG分泌的SER3蛋白改善了蚕丝纤维的物理性能。**
一–d日纤维机械性能。从茧中缫丝20/22 dtex生丝（20个WT或SER茧：在100-200米之间每隔3-4米取一个样品 m以确定机械性能。n个 = SER和n中的22个茧 = WT中有27个茧。一应力和应变曲线。b条压力水平。**c（c）**弹性模量。d日杨氏模量。数据表示为平均值 ± SEM和未配对t检验分析用于(**b-d（英国）**).e（电子）–小时吸湿和解吸性能。从茧中提取的单丝用0.2%碳酸钠煮沸30分钟 min去除外层丝胶蛋白，得到纺织丝素纤维。**e（电子）**吸湿率（恒温恒湿条件：20 °C（摄氏度） ± 2 °C，相对湿度65% ± 3%).（f）吸湿速度。WT和SER丝素纤维样品的拟合曲线方程为 = 12.276–12.163 e-0.0756吨，R2 = 0.9966; v（v） = 13.470-13.370-0.0980吨，R2 = 0.9954. t、时间。克水分释放率（恒温恒湿条件：20 °C（摄氏度） ± 2 °C，相对湿度100%）。小时水分释放速度。WT和SER丝素纤维样品的拟合曲线方程为 = 12.353 + 17.619e-0.03381吨，R2 = 0.9977; v（v） = 13.184 + 23.552e-0.04187吨，R2 = 0.9990. t、时间。**i、 j个**蚕茧的扫描电子显微镜（SEM）表征(我)和丝素纤维(j个). 除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。k个茧丝的XRD图谱。我茧丝结晶度。米茧丝的SAXS衍射图。n个SAXS衍射数据。数据表示为平均值 ± 扫描电镜。n个 = 3个样品(**e（电子）**–n个).

**图4。突变5龄幼虫SG中丝蛋白的合成和分泌。**
一SG横截面的冻结截面。通过EGFP融合表达检测分泌到SG管腔中的SER3蛋白的状态。b条PSG的透射电子显微照片。图4a和b:SF，丝素层；SS，丝胶层；内质网；G、高尔基体；m、线粒体；mf，丝素团；mv，微绒毛。**c（c）**半定量PCR和d日,**e（电子）**qRT-PCR检测SG不同部位细胞中EGFP、SER3和丝素蛋白Fib-H、Fib-L和P25基因的mRNA水平。MA、MM和MP分别显示MSG的前部、中部和后部。PA和PP分别显示PSG的前部和后部。对于d日和**e（电子）**霍尔姆-西达克吨-使用了测试分析第页获得的值为调整后的值第页值。数据表示为平均值 ± 扫描电镜。n个 = 3个样品。每个组织样本都是从三个女性个体中采集的，每个样本都要测量三次。除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。

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