N-Glycans in Immortalized Mesenchymal Stromal Cell-Derived Extracellular Vesicles Are Critical for EV-Cell Interaction and Functional Activation of Endothelial Cells

doi:10.3390/ijms23179539

.2022年8月23日；23(17):9539.

doi:10.3390/ijms2179539。

永生化间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡中的N-甘氨酸对EV细胞相互作用和内皮细胞的功能激活至关重要

附属公司

¹REMAR-IGTP集团，德国Trias i Pujol研究所（IGTP）和肾病科，德国Trias i Pujol大学医院（HUGTiP），Can Ruti校区，08916 Badalona，西班牙。
²巴塞罗那自治大学细胞生物学、生理学和免疫学系，08193 Bellaterra，西班牙。
^三西班牙圣塞巴斯蒂安巴斯克研究与技术联盟（BRTA）糖技术小组CIC生物枪，20014。
⁴巴斯克研究与技术联盟生物科学合作研究中心（CIC bioGUNE）外显子实验室，20850 Derio，西班牙。
⁵生物研究中心，生物材料与纳米药物（CIBER-BBN），20014年，西班牙圣塞巴斯蒂安。
⁶西班牙马德里卡洛斯三世沙龙研究所生物研究中心（CIBERehd），邮编：41092。
⁷巴斯克科学基金会（IKERBASQUE），西班牙毕尔巴鄂48009。
⁸ICREC研究项目，德国健康科学研究所Trias i Pujol，Can Ruti Campus，08916 Badalona，Spain。
⁹iCor，心脏病服务，德国Trias i Pujol大学医院，08916 Badalona，西班牙。
¹⁰西班牙马德里41092卡洛斯三世沙龙研究所CIBERCV。
¹¹西班牙巴塞罗那奥托诺马大学（UAB）医学系，08193。
¹²西班牙维多利亚州加泰罗尼亚中央大学医学院（UVic-UCC），邮编08500。
¹³巴塞罗那大学（UB）细胞生物学、生理学和免疫学系，08007巴塞罗那，西班牙。

PMID： 36076936
预防性维修识别码： PMC9455930型
内政部： 10.3390/ijms23179539

永生间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡中的N-聚糖对EV-细胞相互作用和内皮细胞功能激活至关重要

Marta Clos-Sansalvador公司等。国际分子科学杂志. 2022.

.2022年8月23日；23(17):9539.

doi:10.3390/ijms23179539。

附属公司

¹REMAR-IGTP集团，德国Trias i Pujol研究所（IGTP）和肾脏科，德国Triasi Pujor大学医院（HUGTiP），Can Ruti Campus，08916 Badalona，西班牙。
²西班牙贝拉特拉08193，巴塞罗那大学（UAB）细胞生物学、生理学和免疫学系。
^三西班牙圣塞巴斯蒂安巴斯克研究与技术联盟（BRTA）糖技术小组CIC生物枪，20014。
⁴巴斯克研究与技术联盟生物科学合作研究中心（CIC bioGUNE）外显子实验室，20850 Derio，西班牙。
⁵生物研究中心，生物材料与纳米药物（CIBER-BBN），20014年，西班牙圣塞巴斯蒂安。
⁶西班牙马德里卡洛斯三世沙龙研究所生物研究中心（CIBERehd），邮编：41092。
⁷巴斯克科学基金会（IKERBASQUE），西班牙毕尔巴鄂48009。
⁸ICREC研究项目，德国健康科学研究所Trias i Pujol，Can Ruti Campus，08916 Badalona，Spain。
⁹iCor，心脏病服务，德国Trias i Pujol大学医院，08916 Badalona，西班牙。
¹⁰西班牙马德里41092卡洛斯三世沙龙研究所CIBERCV。
¹¹西班牙巴塞罗那奥托诺马大学（UAB）医学系，08193。
¹²加泰罗尼亚维克中央大学医学院，08500 Vic，西班牙。
¹³巴塞罗那大学（UB）细胞生物学、生理学和免疫学系，08007巴塞罗那，西班牙。

PMID： 36076936
预防性维修识别码： PMC9455930型
内政部： 10.3390/ijms23179539

摘要

间充质基质细胞衍生细胞外囊泡（MSC-EV）由于其免疫调节和再生特性，被广泛认为是MSC细胞给药的无细胞治疗替代物。然而，EV与靶细胞之间的相互作用机制尚未完全了解。表面聚糖可能是EV细胞通讯的关键参与者，是目前仍很少探索的特定分子识别模式。在本研究中，我们重点研究了MSC-EV的N-糖基化作为MSC-EV和内皮细胞相互作用的介质在随后的EV摄取以及诱导细胞迁移和血管生成中的作用。为此，通过大小排阻色谱（SEC）分离永生化沃顿凝胶MSC（iWJ-MSC-EV）中的EV，并用糖苷酶PNGase-F处理以去除野生型N-聚糖。然后，使用HUVEC在体外捕获、琼脂糖斑点迁移和基于基质的试管形成分析的背景下测试CFSE标记的iWJ-MSC-EV。因此，我们发现iWJ-MSC-EV中的N-糖基化对与HUVEC细胞的相互作用至关重要。HUVEC捕获iWJ-MSC-EV，刺激其管状形成能力，促进其招募。相反，通过PNGase-F处理去除N-聚糖会降低天然iWJ-MSC-EV诱导的所有这些功能活性。最后，iWJ-MS-EV和PNGase-F处理的iWJ-MS-EV的比较凝集素阵列发现表面糖基化模式存在显著差异，尤其是在N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、，和岩藻糖结合凝集素。综上所述，我们的结果强调了MSC-EV中N-聚糖的重要性，以允许EV-细胞相互作用和相关功能。

关键词：外泌体；细胞外小泡；聚糖；糖基化；凝集素；间充质干细胞/基质细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
通过SEC从iWJ-MSC条件培养基中分离EV并对其进行表征。(A类)通过基于珠的流式细胞术获得iWJ-MSC-EV的代表性SEC洗脱曲线，无论是否用PNGase-F处理，EV和MSC标记物CD63、CD9和CD90呈阳性。蛋白质洗脱在280nm吸光度下进行测量，然后进行；(B类)未经处理和PNGase-F处理的iWJ-MSC-EV之间MSC-EV标记物的比较分析。每个点对应独立的EV特征。统计差异显示为*对<0.05和****对通过双向方差分析（ANOVA）和谢亚克多重比较试验得出<0.0001；(C类)通过低温透射电子显微镜（cryo-TEM）拍摄的未处理和PNGase-F处理iWJ-MSC-EV的代表性图像。iWJ-MSC-EV是50-500nm的双膜纳米囊泡，与治疗无关。比例尺为250 nm；(D类)两种iWJ-MSC-EV的Calnexin和ezrin斑点印迹。PBMC细胞裂解液用作阳性对照。

图2
孵育1小时后，HUVEC捕获未经处理和PNGase-F处理的iWJ-MSC-EV。(A类)HUVEC对EV摄取的代表性流式细胞术分析，以计数图表示（CFSE的%⁺细胞）；(B类)流式细胞术定量HUVEC的MFI。三个生物复制用一个或两个实验复制表示；(C类)荧光显微镜摄取分析。HUVEC与PBS（对照）、未经处理的iWJ-MSC-EV-CFSE和经PNGase-F处理的iW J-MSC-EV-CFSE的代表性图像。绿色信号对应于CFSE标记的EV，红色通道用于控制可归因于自荧光的信号，如二者的共同定位所示（右）。在40×（油物镜）下拍摄图像；(D类)根据绿色区域/细胞和G/R比率校正后的平均强度/细胞量化EV摄取。来自两个独立实验的数据，每个条件至少有15张图像。统计差异显示为*对<0.05和****对通过Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后分析，<0.0001。

图3
N-糖基化对iWJ-MSC-EV的招募和促血管生成功能很重要(A类,B类)琼脂糖斑点试验中iWJ-MSC招募HUVEC；(A类)HUVEC在所有条件下迁移的代表性图像（10×）。琼脂糖斑点的边界用虚线表示；(B类). HUVEC迁移的量化。每个图像中距离斑点极限最远的三个细胞的距离被量化。此外，琼脂糖斑点内细胞所占的面积；(C类)所有条件下血管生成的代表性图像（10×）；(D类)量化血管生成，如形成的节点数和管形成的总分支长度。来自两个独立实验的数据，每个条件至少重复3次。统计差异显示为*对<0.05和**对<0.01，通过Kruskal–Wallis检验和Dunn的事后分析。

图4
(A类)iWJ-MSC-EV和PNGase-F处理的iWJ-MSC-EV凝集素全阵列分析；(B类)PNGase-F处理后结合信号保持稳定的结合凝集素的表示；(C类)受PNGase-F处理影响的结合凝集素的表示。数据来自每个凝集素的两个生物重复和6个不同的技术重复。统计差异显示为*对<0.05和***对<0.001乘以倍数吨-测试。男人:*甘露糖*;*GlcNAc公司*:*N-乙酰氨基葡萄糖*;操:*岩藻糖*;西亚:*唾液酸*;*GalNAc公司*:*N-乙酰氨基半乳糖*.

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