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.2022年8月4日；25(9):104872.
doi:10.1016/j.isci.2022.104872。 eCollection 2022年9月16日。

低氧诱导HMGB1通过RAGE促进胶质瘤干细胞自我更新和致瘤性

叶翠芳 1, 李欢 1, 李亚超 1, 杨章 1, 刘国浩 2, 海龙蜜 1, 李红莲 1, 群根晓 2, 李牛 三, 新疆余 1
附属公司

低氧诱导HMGB1通过RAGE促进胶质瘤干细胞自我更新和致瘤性

叶翠芳等。 i科学. .

摘要

缺氧小生境中的胶质瘤干细胞（GSC）有助于胶质母细胞瘤（GBM）的肿瘤发生、发展和复发。缺氧诱导肿瘤细胞释放高迁移率族蛋白1（HMGB1），促进肿瘤的发展。在这里，我们报告HMGB1在人类GBM标本中过度表达。低氧促进GSC中HMGB1的表达和分泌。此外，HMGB1沉默会导致干细胞标记物的丢失和GSC自我更新能力的降低。此外，HMGB1敲除抑制RAGE依赖的ERK1/2信号通路的激活，并阻止GSC中的细胞周期。一贯地，RAGE抑制剂FPS-ZM1下调HMGB1表达和ERK1/2磷酸化，导致GSC增殖减少。在GBM异种移植小鼠中，HMGB1敲除抑制肿瘤生长并促进小鼠生存。总之，这些发现揭示了HMGB1在调节GSC自我更新潜力和致瘤性方面的重要功能。

关键词：生物科学；癌症；细胞生物学；微环境；分子生物学。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
HMGB1与胶质瘤侵袭性相关，在TCGA数据库中正常脑（n=10）和胶质母细胞瘤（GBM，IDH野生型，n=528）中GSCs（A）HMGB1 mRNA表达升高。显著性通过Mann-Whitney U检验确定。wt，野生型。（B） CGGA数据库中HMGB1表达分层的IDH野生型胶质瘤患者的Kaplan-Meier生存分析。HMGB1表达中位数用于分层，分为HMGB1高组和HMGB1低组。（C和D）HMGB1在正常人脑和不同级别胶质瘤中的免疫组织化学染色。（C） 矩形框的相应放大图像位于左下方。显示了具有代表性的图像。比例尺，50μm。（D） HMGB1在正常人脑和胶质瘤中表达的定量分析。HMGB1免疫染色强度通过积分光密度（IOD，面积×平均光密度）进行评估。将数据归一化为非肿瘤组，并表示为平均值±SD。采用Tukey检验进行单因素方差分析。非肿瘤，n=11；星形细胞瘤（IDH突变，2级），n=11；星形细胞瘤（IDH突变，3级），n=5；GBM（IDH重量），n=24。ns，无意义，p＜0.0001。（E和F）人类GBM样本中HMGB1（绿色）和干细胞标记物（CD15、CD133、SOX2或Olig2；红色）的免疫荧光双重染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。（E） 显示了具有代表性的图像。箭头显示HMGB1和干细胞标记共同表达的细胞。比例尺，25μm。放大图像位于右侧。比例尺，10μm。（F） 干细胞标记物阳性（+）或阴性（-）细胞中HMGB1免疫反应的定量分析。将数据归一化为干细胞标记阴性细胞组，并表示为平均值±SD。每个点表示单个细胞，n=106个来自三个人类GBM样本的总细胞（每个样本20–50个细胞）。显著性通过Mann-Whitney U检验确定，p<0.0001。另请参见图S1。
图2
图2
低氧诱导HMGB1在GSCs（A和B）HE染色和HMGB1的IHC染色中的表达和释放，以及人类GBM标本连续切片中的低氧标记物（CA9或HIF-1α）。（A） 显示了具有代表性的图像。矩形方框显示肿瘤坏死灶周围的假栅栏。比例尺，200μm。（A1）–（A4）相应左侧图像中矩形框的放大图像。显示了具有代表性的图像。比例尺，50μm。（B） 定量分析假栅栏内（+）或外（-）HMGB1或HIF-1α阳性细胞的百分比。数据表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=10个高功率场，p<0.0001。（C和D）人类GBM标本中HMGB1（绿色）和低氧标记物（CA9或HIF-1α，红色）的免疫荧光双重染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。（C） 矩形框的放大图像位于下面板中。显示了GBM样本的代表性图像。比例尺，25μm。（D） 定量分析HIF-1α阳性（+）或阴性（-）细胞中HMGB1表达的细胞质/核比率。将数据归一化为HIF-1α阴性细胞的荧光强度，并表示为平均值±SD。每个点代表一个细胞，n=205个来自三个人类GBM样本的细胞总数（每个样本50–70个细胞）。显著性通过Mann-Whitney U检验确定，p<0.0001。（E） 在标准条件下培养的GSC中HMGB1和HIF-1αmRNA水平的qPCR分析2)或缺氧（1%O2)24小时内，数据被归一化为常氧组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组重复3次。*，p<0.05；***，p<0.001，p<0.0001。（F和G）Western blot和定量分析低氧培养不同时间的GSC中HMGB1和HIF-1α蛋白表达。（F） 显示了具有代表性的斑点。（G） 将数据归一化为0 h组，并表示为平均值±SD。通过Mann-Whitney U检验确定显著性。n=每组4个重复。*，p<0.05。（H和I）Western blot和定量分析HMGB1蛋白在低氧24小时的匹配GSC和非GSC中的表达。（一） 将数据归一化为非GSC组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。每组n=3个重复。*，p<0.05。（J） 常氧或缺氧72小时GSC培养上清液中HMGB1的ELISA分析。数据表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生t吨测试*，p<0.05。（K） 正常人群和人脑胶质瘤患者术前血清HMGB1的ELISA分析。数据表示为平均值±标准偏差，显著性通过Tukey检验进行单因素方差分析。正常人群，n=3；星形细胞瘤（IDH突变，2级），n=8；星形细胞瘤（IDH突变，3级），n=10；GBM（IDH野生型），n＝15。ns，无意义；**，p<0.01；***，p<0.001。（L和M）Western blot和定量分析缺氧24小时HIF-1α敲除的GSC中HMGB1和HIF-1β蛋白表达#3808和#3809，两个不同的shHIF-1α序列。（M） 数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD NT，非目标序列。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组重复3次。*，p<0.05；**，p<0.01，p<0.0001。（N和O）Western blot和定量分析缺氧24小时HIF-2α敲除的GSC中HMGB1和HIF-2蛋白表达#3805和#3806，两个不同的shHIF-2α序列。（O） 数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。每组n=3个重复。*，p<0.05；**，p<0.01，p<0.0001。（P和Q）Western blot和定量分析正常氧下DMOG处理48 h的GSC中HIF-1α和HMGB1。（P） 显示了具有代表性的斑点。（Q） 数据归一化为0 mM DMOG组（DMSO治疗），并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组4个重复。*，p<0.05；**，p<0.01。另请参见图S2。
图3
图3
HMGB1促进GSCs（A和B）的增殖和成瘤，并定量分析HMGB1、Olig2、GFAP，以及缺氧24小时shNT或shHMGB1的GSCs中PARP的裂解表达。（A） 显示了具有代表性的斑点。（B） 数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD NT，非目标序列#932和#934，两个不同的shHMGB1序列。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组重复3次。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。（C） GSC在缺氧条件下不同天数（0、1、3和5）的细胞存活率。数据归一化为0天组，表示为平均值±标准偏差。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。每组3个重复，与shNT组相比，p<0.001。（D和E）GSCs与shHMGB1在缺氧条件下7天的瘤球形成分析。（D） 显示了具有代表性的图像。比例尺，200μm。（E） 肿瘤球数量的定量分析。数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组3个重复，p<0.0001。（F）体外低氧7天GSC的极限稀释试验**，p<0.01，与shNT组相比，p＜0.0001。每组重复3次。（G和H）荧光图像和EdU掺入GSC肿瘤层在缺氧24小时的定量分析（G）显示了代表性图像。比例尺，50μm。（H） EdU阳性（+）细胞的定量分析。数据表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组3个重复，p<0.0001。（一） 移植后28天异种小鼠大脑的苏木精和伊红（HE）染色。显示了具有代表性的图像。箭头显示肿瘤。比例尺，10 mm。（J） 表达shNT或shHMGB1的D456 GSCs植入小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。采用对数秩检验进行显著性分析。每组n=5。**，与shNT小鼠相比，p<0.01。（K） GBM异种移植小鼠中HMGB1（绿色）、Ki67（红色）、裂解caspase3（红色）或GFAP（红色）的免疫荧光染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。比例尺，100μm。矩形图像的放大图像位于右侧。显示了具有代表性的图像。比例尺，25μm。另请参见图S3。
图4
图4
HMGB1通过GSC中RAGE依赖性ERK1/2信号通路促进细胞周期进展（A）qPCR分析缺氧24小时GSC中的RAGE、TLR2和TLR4 mRNA水平。数据归一化为常氧组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对Student’st吨测试。每组3个重复，p<0.001，p<0.0001。（B和C）Western blot和定量分析低氧条件下24小时HMGB1敲低的GSC中TLR2和TLR4的表达。（B）显示了代表性的blot。（C） 数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。每组重复3次。ns，无显著性。（D） 采用Pearson相关分析，从CGGA数据库中对GBM（IDH wt）患者HMGB1 mRNA表达与AGER（RAGE mRNA）的相关性。n=288，r=0.4494，p<0.0001。（E和F）人类GBM标本中HMGB1（红色）和RAGE（绿色）的免疫荧光双重染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。（E） 显示了具有代表性的图像。比例尺，25μm。（F） 在总细胞中共表达HMGB1和RAGE的细胞的定量分析。数据表示为每个GBM样本（n=3）的平均值±SD 9随机显微镜视野。基于CGGA数据集，（G和H）GSEA和heatmap显示HMGB1高表达的GBM患者的细胞周期进展基因上调。NES，标准化浓缩分数。FDR，错误发现率。（I和J）低氧条件下24小时HMGB1敲低的GSC中RAGE依赖性ERK1/2信号分子表达的Western blot和定量分析（I）显示了典型的blot。（J） 数据归一化为shNT组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组重复3次。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图5
图5
来源于表达shHMGB1的GSCs的异种移植小鼠表现出对RAGE依赖性ERK1/2信号通路的抑制HMGB1（绿色）和RAGE、ERK1/2、磷酸化ERK1/2的免疫荧光双染色(第页-ERK1/2）、CCND1、CDK4或p21（红色）。DAPI染色细胞核（蓝色）。比例尺，100μm。矩形图像的放大图像位于右侧。显示了具有代表性的图像。比例尺，25μm。
图6
图6
抑制RAGE损伤GSC的自我更新（A）FPS-ZM1的化学结构和缺氧条件下FPS-ZM2处理48小时后GSC中RAGE表达的Western blot分析。（B） 用FPS-ZM1处理的GSCs在缺氧条件下的细胞活力。0μm FPS-ZM1（DMSO处理）作为对照组。将数据归一化为第0天组，并表示为平均值±标准偏差。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组3个重复，与0μm组相比，p<0.0001。（C和D）FPS-ZM1处理的GSC缺氧48小时后的瘤球形成分析（C）显示了代表性图像。比例尺，50μm。（D） 肿瘤数目的定量分析。将数据归一化为0μm组，并表示为平均值±标准偏差。通过双尾非配对学生t吨测试。n=3个重复，每组。**，p<0.01，p<0.0001。（E和F）荧光图像和EdU掺入GSC肿瘤细胞48小时缺氧的定量分析（E）显示了代表性图像。比例尺，50μm。（F） EdU阳性（+）细胞分数的定量分析。数据表示为平均值±标准差显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=3个重复，每组。**，p<0.01。（G和H）Western blot和定量分析低氧条件下FPS-ZM1处理48 H的GSC中HMGB1和RAGE依赖ERK1/2信号分子的表达。（G） 显示了具有代表性的斑点。（H） 数据归一化为0μM FPS-ZM1（DMSO治疗）组，并表示为平均值±SD。显著性由双尾非配对学生的t吨测试。n=每组重复3次。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，p<0.0001。
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