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.2022年7月25日；13(1):4268.
doi:10.1038/s41467-022-31981-2。

整合素α3β1通过钙介导的大胞饮作用和溶酶体胞吐作用促进胶质母细胞瘤相关内皮细胞的血管形成

恩永贝 1, 黄萍（Ping Huang） 1, 加勒·穆勒·格雷文 1, 多洛雷斯·汉巴德祖曼 2, 安德鲁·爱德华·斯隆 三 4, 艾米·诺瓦基 5, 尼古拉斯·马尔科 6, 凯瑟琳·卡林 4 7, 坎迪斯·L·格拉德森 8 9 10
附属公司

整合素α3β1通过钙介导的大胞饮作用和溶酶体胞吐作用促进胶质母细胞瘤相关内皮细胞的血管形成

恩永贝等。 国家公社. .

摘要

针对胶质母细胞瘤血管生成的治疗效果好坏参半。肿瘤相关血管生成的研究集中于刺激内皮细胞发芽、迁移和过度增殖的因素。然而，对于肿瘤相关血管形成的过程知之甚少。为了解决这个问题，我们研究了CD31中的血管形成+从人类胶质母细胞瘤肿瘤中分离的细胞。结果表明，整合素α3β1的过度表达在促进胶质母细胞瘤中肿瘤相关内皮细胞的管形成中起着重要作用。阻断α3β1功能可降低肿瘤相关内皮细胞的芽生和管状形成，并降低胶质母细胞瘤器官型培养中的血管密度。数据进一步表明了一种机制模型，其中整合素α3β1促进钙内流刺激大松果体的大量胞饮作用和定向成熟，从而在新生管腔形成期间促进溶酶体胞吐。总之，我们的数据表明整合素α3β1可能是胶质母细胞瘤血管系统的治疗靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。与NEC相比，TEC形成的管和芽数量增加，并且TEC形成管的速度更快。
一,b条NEC（422）和TEC（分离物ccf2687）培养48 方法中描述的胶原蛋白凝胶中的h。代表性图像如所示一,b条是通过双边Wilcoxon秩和检验进行的相应统计分析。黄色箭头表示管。n个 = 每组6个不同的字段。c（c）,d日NEC（623）和TEC（分离物ccf2445）在Matrigel上培养24小时 h或48 h.代表性图像如所示c（c）,d日是通过双边Wilcoxon秩和检验进行的相应统计分析。黄色箭头表示试管，红色箭头表示芽。对于管子数量，n个 = 每组12个不同的字段；并且对于芽数，n个 = 每组6个不同的字段。红色和黑色条b条,d日用95%置信区间表示平均值。e（电子）前9个月NEC（376）和TEC（隔离ccf2515）的实时视频显微镜 Matrigel上的文化。显示了具有代表性的图像。（f）Matrigel上由NECs（376和422）和TECs（分离物ccf2445和ccf2566）形成的管的基底膜中层粘连蛋白α5链（sc-16592；Alexa-Fluro-594；红色）的免疫荧光染色12和24 h.细胞核DAPI染色（蓝色）。独立实验至少进行了两次，结果相似。源数据作为源数据文件提供。
图2
图2。与NEC相比，人类胶质母细胞瘤TEC中整合素α3亚单位的表达升高。
一,b条当Matrigel上形成类似密度的试管时，从3个NEC（376、422和623）和3个TEC（分离物cw880、ccf2352和ccf2390）中提取总RNA，并且c（c）,d日来自6个TEC（cw850、cw880、ccf2277、ccf2352、ccf2388和ccf2390）和3个NEC（375、422和623）的单层，然后是基因表达微阵列（HG-U219）。一,c（c）使用DAVID生物信息学资源6.8对TEC中上调2倍以上的基因进行基因集富集和通路分析(https://david.ncifcrf.gov网址)，其中第页-这些值是通过Fisher精确检验计算得出的。b条,d日整合素和与血管生成相关的基因在基质和单层中的表达谱显示为热图；第页-这些值是通过双边精确加权秩和检验获得的，没有对多重比较进行调整。e（电子）使用NECs（623、376和422）和TECs（ccf2445、ccf2566和ccf2515）单层从相同实验中获得的细胞裂解物与指示的抗体平行进行western blot分析。（f）Matrigel（24）上NEC（376）或TEC（ccf2566）形成的试管的整合素α3染色的典型共焦图像 h） ●●●●。图表示整合素α3免疫荧光的积分密度。克对人GBM和正常脑（NB）标本的石蜡切片进行整合素α3和vwf双重标记，然后进行DAPI染色。显示了具有代表性的图像。基于曼德斯系数（M1），GBM切片中整合素α3信号与vwf信号的共聚焦率为86% = 0.863; 平方米 = 0.515).小时含有NB的人GBM组织阵列对vwf和整合素α3、CD151或整合素β6进行双重标记。统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验；红线表示平均值，黑线表示95%置信区间。我用免疫荧光法对小鼠胶质瘤切片进行整合素α3、CD151或整合素β6和CD31的双重标记。使用ImageJ从肿瘤或邻近NB获得CD31阳性像素/场上整合素α3、CD151或整合素β6的平均荧光强度，并用箱线表示。方框表示第一和第三个四分位数，条带表示中位数，胡须表示±1.5的四分位数范围。统计分析：线性混合模型；红色条，表示。(小时,我)在x个轴，n个=不同字段的数量。e（电子）–克独立实验至少进行了两次，结果相似。源数据作为源文件提供。
图3
图3。一种针对整合素α3β1的功能阻断抗体可显著减少TEC的试管和芽形成。
一,c（c）NEC（623）或TEC（分离物ccf2445）与针对整合素α3亚单位或整合素β6亚单位的功能阻断抗体或对照IgG（小鼠IgG或大鼠IgG）在5 在M199培养基+10%FBS中，43人，在生长因子诱导的Matrigel上镀上µg/ml h.显示了具有代表性的图像。b条,d日小鼠IgG或大鼠IgG治疗组的试管或芽的平均数量表示为100%。点图显示试管或芽数的%平均值（红线）和95%置信区间（黑线）。统计分析：双边Wilcoxon秩和检验。独立实验至少进行了两次，结果相似。n个表示不同字段的数量。b条这个n个对于管子：NEC，n个 = 12用于小鼠IgG和n个 = 10代表抗整合素α3；和TEC，n个 = 12用于小鼠IgG和n个 = 11代表抗整合素α3。这个n个芽苗：TEC，n个 = 6用于小鼠IgG和n个 = 6表示抗整合素α3。d日这个n个对于管子：NEC，n个 = 大鼠IgG和n个 = 抗整合素α6为12；和TEC，n个 = 大鼠IgG和n个 = 12表示抗整合素α6。这个n个芽苗：TEC，n个 = 大鼠IgG和n个 = 6表达抗整合素α6。源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。一种针对整合素α3β1的功能阻断抗体可降低器官型培养中GBM肿瘤的血管密度。
一实验程序示意图。简言之，GBM肿瘤（ccf4259、ccf4268、ccf4272和DI247）切割成~4 直径为mm的细胞在Matrigel培养基中培养，加入1 ng/ml EGF和1 纳克/毫升bFGF。第2天，在每个肿瘤块的三个位置注射抗整合素α3亚单位阻断抗体或对照小鼠IgG，以达到~5 肿瘤体积为µg/ml。第6天重复相同的注射。第9天，用10%福尔马林和石蜡包埋肿瘤。用兔抗CD31抗体和Alexa-Fluro-488山羊抗兔IgG标记切片，然后进行DAPI核染色和成像。b条显示了来自肿瘤ccf4272的器官型培养物的代表性免疫荧光图像。c（c）通过使用ImageJ进行图像处理，获得每个场CD31-阳性区域的百分比。n个表示不同字段的数量，对于ccf4269，n个 = 44用于小鼠IgG和n个 = 抗整合素α3为95；对于ccf4268，n个 = 39用于小鼠IgG和n个 = 103代表抗整合素α3；对于ccf4272，n个 = 57用于小鼠IgG和n个 = 抗整合素α3 82；对于DI-247，n个 = 59用于小鼠IgG和n个 = 88代表抗整合素α3。方框表示第一和第三个四分位数，条带表示中位数，胡须表示±1.5的四分位数范围。采用线性混合模型进行统计分析(第页 < 0.001). 源数据作为源数据文件提供。
图5
图5。整合素α3β1/CD151促进的大胞饮作用在TEC中较高，抑制大胞饮减少了管的形成。
一NEC（422和623）和TEC（分离物ccf3889、DI-167和DI-337）与25 30μg/ml TMR-dex min，然后进行成像。n个表示不同字段的数量：NEC，n个 = 422和n个 = 623为20；和TEC，n个 = 每个隔离物30个。显示了具有代表性的图像。大胞饮指数定义为（总TMR-dex面积/总细胞面积） x个 每个场100个，大胞浆体数定义为每个场细胞中大胞浆体的平均数。统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验。调整群体效应后，采用线性回归模型分析大松果体指数与大松果体数的相关性；相关图中的阴影区域表示回归线的95%置信带。b条用二甲基亚砜（车辆控制；n个 = 11） 或100 nM环境影响评价(n个 = 11） 用于10 min随后与TMR-dex孵育30 分钟，然后进行成像。统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验。c（c）TEC（分离株cf2390和ccf2687）的管形成是通过Matrigel上6天后每个字段形成的管数进行量化的 M199中的h + DMSO存在下10%FBS（车辆控制；n个 = ccf2390为18，以及n个 = ccf2687为18）或50 nM环境影响评价(n个 = ccf2390为18，以及n个 = ccf2687为18）。统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验。d日,e（电子）TEC（分离物ccf2390）预处理3 具有整合素α3阻断抗体的h(n个 = 23）或小鼠IgG(n个 = 23）和TEC（分离物DI-102）用CD151的阻断抗体预处理(n个 = 11） 或小鼠IgG(n个 = 9） ，然后培养30名TEC TMR-dex的最小值。统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验。（f）显示48小时TEC（分离物ccf3889）整合素α3和CD151的免疫印迹 用siRNA转染整合素α3或CD151后h。这些免疫印迹至少进行了两次，在不同的通道中装载的细胞裂解物样品来自独立的复制品。48岁时 用siRNA转染后h，TEC（分离物ccf3889）与TMR-dex孵育15小时 最小值。n个=不同字段数：整合素α3，n个 = siintegrinα3-1和n个 = siintegrinα3-2为16；CD151，n个 = 17用于siCD151；和对照siRNA，n个 = 16.显示了具有代表性的图像。统计分析：Dunn方法用于将每个siRNA与ConRi进行配对比较。方框表示第一和第三个四分位数，条带表示中位数，胡须表示±1.5的四分位数范围。虚线表示一–（f）。源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。钙2+-介导的大胞饮作用和溶酶体胞吐作用是管形成过程的一部分，并通过钙被整合素α3β1增强2+-大量涌入。
一TEC（分离物ccf2390）与25 3μg/ml TMR-dex 37小时 °C，然后固定和渗透。显示的代表性图像；黄色箭头表示TMR-dex和LAMP1共同定位。根据曼德斯系数（M1），Colocalization为99% = 0.999; 平方米 = 0.058). 独立实验至少进行了两次，结果相似。b条实验程序示意图c（c）,d日粘附的TEC（分离物ccf3889）与100 15μg/ml TMR-dex 37分钟 °C，清洗，收获，标记为5 µg/ml Alexa-Fluro-647结合-WGA悬浮液，清洗并在Matrigel上电镀20 h.代表性三维(c（c）)和横截面(d日)管子的图像。e（电子）,（f）粘附的TEC（分离物ccf2390）与100 15μg/ml TMR-dex 37分钟 °C，清洗、收获并在Matrigel上电镀3次 h带有(n个 = 12） 或不带0.5 mM EGTA公司(n个 = 10) (e（电子）)，或在存在小鼠IgG的情况下(n个 = 21）或整合素α3抗体(n个 = 21）(（f）)然后用LAMP1单克隆抗体H4A3进行固定和标记。克DMEM中的TEC（隔离ccf3889） + 用5%的FBS（对照培养基）或无钙培养基处理(n个 = 20） 或不带0.5 mM EGTA公司(n个 = 20） 用于15 min，然后与100孵育 15μg/ml TMR-dex 37分钟 °C，并固定。显示了面板的代表性图像e（电子）–克.小时DMEM中的TEC（隔离ccf3889） + 5%的FBS在Matrigel上与(n个 = 36）或不带0.5 mM EGTA公司(n个 = 36）用于18 小时。克,小时统计分析：双侧Wilcoxon秩和检验。n个=不同字段的数量。方框表示第一和第三个四分位数，条带表示中位数，胡须表示±1.5的四分位数范围。虚线表示平均值。我,j个细胞内钙增加2+通过细胞外钙2+内流通过Fluo-8（Ex/Em）的荧光强度测量 = 490/525). 为了耗尽细胞内钙储存，TEC（分离物DI-102）用1 在向培养基中添加细胞外CaCl2之前，添加µM Thapsigargin（TH）。数据点表示3次重复的平均值，条形表示标准误差。j个TEC（分离物DI-102）与小鼠IgG或阻断抗整合素α3抗体预先孵育，然后添加TH和CaCl2。统计分析：线性混合模型。k个建议的TEC管形成模型。TEC管形成机制需要大量胞饮和溶酶体胞吐。源数据作为源数据文件提供。
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