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.2022年8月：82:104139。
doi:10.1016/j.ebiom.2022.104139。 Epub 2022年7月8日。

通过组蛋白修饰抑制DYRK1A促进心肌梗死后心肌细胞周期激活和心脏修复

丛兰 1, 陈彩玉 2, 双曲 2, 念曹 三, 郝罗 2, 程宇 2, 王娜 2, 袁正学 2, 夏雪薇（Xuewei Xia） 2, 赵凡 2, 任红梅 2, 杨永健 4, 佩德罗·A·何塞 5, 徐在成 6, 耿泽武 7, 曾春雨 8
附属公司

通过组蛋白修饰抑制DYRK1A，促进心肌细胞周期激活和心肌梗死后的心脏修复

丛兰等。 EBioMedicine公司. 2022年8月.

摘要

背景：虽然成年哺乳动物的心脏仅通过心肌细胞增殖进行适度更新，但促进这一过程被认为是修复心脏损伤的一种有前景的治疗策略。本研究探讨了双特异性酪氨酸调节激酶1A（DYRK1A）在心肌梗死（MI）后调节心肌细胞周期激活和心脏修复中的作用和机制。

方法：使用DYRK1A-基因敲除小鼠和DYRK1A抑制剂研究DYRJ1A在心肌梗死后心肌细胞周期激活和心脏修复中的作用。此外，我们通过结合全基因组转录组学、表观基因组学和蛋白质组学分析，探索了潜在机制。

调查结果：在患有心肌梗死的成年小鼠中，DYRK1A的条件缺失和药物抑制均诱导心肌细胞周期激活和心脏修复，并改善心脏功能。结合全基因组转录组学和表观基因组分析显示，DYRK1A基因敲除导致心肌细胞周期活跃（许多调控细胞增殖的基因表达增强），与三甲基组蛋白3 Lys4（H3K4me3）和乙酰化组蛋白3 Lys27（H3K27ac）沉积增加相关这些基因的启动子区域。从机理上讲，通过无偏质谱分析，我们发现WD重复序列蛋白82和赖氨酸乙酰转移酶6A是H3K4me3和H3K27ac表观遗传修饰以及随后的促增殖转录组和心肌细胞周期激活的关键介质。

解释：我们的结果揭示了DYRK1A在心脏修复中的重要作用，并提示了治疗心肌病的潜在药物靶点。

基金：本研究部分得到了国家自然科学基金（81930008，82022005，82070296，82102834）、国家重点研发计划（2018YFC1312700）、国家自然基金创新研究团队计划（81721001）的资助，和国家卫生研究院（5R01DK039308-31，7R37HL023081-37，5P01HL074940-11）。

关键词：心脏修复；心肌细胞周期激活；DYRK1A；H3K27ac；H3K4me3。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
DYRK1A缺失促进心肌细胞周期重入，改善成年心肌梗死后的心脏修复。(一)DYRK1A在小鼠心脏发育期间和成年小鼠心肌梗死后的表达。(a1级)免疫印迹法检测出生后第1天（P1）和成年小鼠心脏（每组6只小鼠）中DYRK1A的表达。显示了代表性免疫印迹（左）和蛋白质水平定量（右）。⁎⁎⁎对与P1组相比<0.001。(a2类)成年小鼠接受心肌梗死或三次手术，心肌梗死后第7天测定DYRK1A在心脏中的蛋白表达(n个=每组6只小鼠）。显示了代表性免疫印迹（左）和蛋白质水平定量（右）。⁎⁎⁎对与假手术组相比，<0.001。(b)DYRK1A（DYRK1A CKO）心肌细胞特异性缺失示意图。DYRK1A公司flox/flox公司小鼠与α-MHC杂交MerCreMer公司小鼠产生他莫昔芬诱导的DYRK1A CKO小鼠。(c（c）)实验装置概述。每隔一天腹腔注射三苯氧胺三次后，对照组（αMHCMerCreMer公司)和α-MHCMerCreMer公司/DYRK1A公司flox/flox公司将小鼠（DYRK1A CKO）置于心肌梗死状态。每隔7天进行一次超声心动图检查，直到心脏被切除，而在第7天和第35天分别进行增殖和组织学分析。(d日)DYRK1A在α-MHC心脏中的删除效率验证MerCreMer公司/DYRK1A公司flox/flox公司老鼠(n个=每组6只小鼠）。显示了代表性免疫印迹（左）和蛋白质水平定量（右）。⁎⁎⁎对与对照组相比<0.001。(e–g)DYRK1A调节心肌细胞周期活性体内Ki67-的免疫荧光染色（左）和定量（右）(e（电子）)，pH3-(（f）)和Aurkb-(克)显示了对照或DYRK1A CKO小鼠梗死周围区域中的阳性心肌细胞。Ki67-、pH3-和Aurkb-阳性心肌细胞用箭头表示。比例尺=40μm ine（电子）和（f）; 标尺=20μm in克CMs：心肌细胞（每组5只小鼠中>10000个心肌细胞）。⁎⁎⁎对与对照组相比<0.001。(小时)DYRK1A调节心肌细胞胞质分裂在体外从8周龄对照组（αMHC）分离成年心肌细胞后，进行活细胞的时间显微镜成像MerCreMer公司)和α-MHCMerCreMer公司/DYRK1A公司flox/flox公司小鼠（新生期AAV9-GFP感染诱导的心肌细胞GFP表达）并与原代新生大鼠心肌细胞共培养7天。只统计完成胞质分裂的分裂事件。显示了心肌细胞胞质分裂的典型图像和量化。比例尺为50µm。CMs：心肌细胞（每组追踪5只小鼠的3000多个成年心肌细胞）。⁎⁎⁎与对照组相比，P<0.001。(i-l公司)成人对照组或DYRK1A CKO小鼠心脏功能的超声心动图分析。显示了典型的M模式追踪图像（心肌梗死后第35天）和定量分析。LVEF：左室射血分数；LVFS：左心室缩短分数；LVIDs：收缩期左心室内径(n个=每组8只小鼠）。⁎⁎⁎对与对照组相比<0.001。(米)心肌梗死后第35天的心脏重量与体重（HW/BW）之比（n=10）。⁎⁎对与对照组相比<0.01。(n个)代表性图片(n1个)和量化(氮气)心肌梗死后35天分离的心肌细胞的细胞大小。每个心脏随机选择80到100个细胞(n个=8). 比例尺为50µm。⁎⁎对与对照组相比<0.01。(o个)在心肌梗死后第35天测定每个心脏的游离心肌细胞总数(n个=8).⁎⁎对与对照组相比<0.01。(第页)对照组和DYRK1A CKO小鼠心肌梗死的纤维化区域。马森三色染色(第1页)和量化(第2页)心肌梗死后第35天进行了心脏纤维化瘢痕的检查(n个=每组5只小鼠）。从心尖到动脉闭塞部位，以500μm的间隔进行连续横切面。比例尺=1 mm。⁎⁎对与对照组相比<0.01。所有数据均表示为平均值±SD。除j–我，其中使用了单向方差分析，然后使用了Tukey的多重比较测试。
图2
图2
DYRK1A敲除诱导控制心肌细胞周期激活的网络的转录重编程。(一)转录组分析的工作流程示意图。(b)RNA-sequencing（RNA-seq）分析的热图图谱，显示转染scramb（si-NC）或DYRK1A-siRNA（si-DYRK1A）的原代新生儿心肌细胞中差异表达的基因(n个=每组3个样本）。(c（c）)对si-DYRK1A心肌细胞（相对于si-NC组）上调基因的基因本体（GO）分析显示，与细胞增殖相关的多个显著丰富的GO术语。(d日)上调细胞周期调节因子的热图图（相对于si-NC组）。(e–f)通过qRT-PCR和免疫印迹法验证RNA-seq中选定的细胞周期调控因子(n个=每组4个样本e（电子）;n个=每组6个样本（f）). 代表性免疫印迹（左）和蛋白质水平定量（右）如所示（f）. (⁎⁎对<0.01,⁎⁎⁎对<0.001）与si-NC组比较。(克)si-NC和si-DYRK1A心肌细胞差异表达基因的动态偏差。基因集富集分析用于分析调控细胞周期的基因簇。对于e–f，所有条表示平均值±SD，并使用双尾非配对Student t检验分析数据。
图3
图3
DYRK1A敲除增加H3K27ac和H3K4me3在心肌细胞细胞周期基因启动子上的沉积。(一)DYRK1A基因敲除诱导组蛋白修饰的变化在体外免疫印迹法显示组蛋白修饰的整体变化，使用从原代培养的心肌细胞中提取的蛋白转染Scramb（si-NC）或DYRK1A siRNA（si-DYRK1A）48小时(n个=每组6个样本）。显示了代表性免疫印迹（左）和蛋白质水平定量（右）。⁎⁎⁎与si-NC组相比，P<0.001。(b)H3K4me3和H3K27ac ChIP-seq的工作流程示意图。(c（c）)染色体上H3K4me3或H3K27ac ChIP-seq峰的分布。根据染色体在最外环的位置，对H3K4me3和H3K27ac富集的位置进行了对齐。(d日)H3K4me3或H3K27ac结合峰的基因组分布饼图，包括启动子、5′UTR、3′UTR，外显子、内含子和基因间区域。(e（电子）)用si-NC或si-DYRK1A转染的心肌细胞中的ChIP-seq密度热图。信号根据转录起始位点峰值±2k bp范围内的H3K4me3和H3K27ac读取强度进行排序。(（f）)H3K4me3或H3K27ac ChIP-seq数据轨迹的可视化。选择细胞周期基因，并使用综合基因组学查看器屏幕截图显示代表性峰值。(克)Motif分析显示代表性转录因子的结合基序在激活细胞周期活性和心肌细胞增殖中发挥作用。(小时)对si-DYRK1A处理的心肌细胞启动子上H3K4me3（左）和H3K27ac（右）沉积增加的基因进行GO分析。对于一，所有条表示平均值±SD，数据采用双尾非配对Student t检验进行分析。
图4
图4
抑制DYRK1A可降低KAT6A和WDR82磷酸化，从而诱导心肌细胞H3K27ac和H3K4me3修饰。(一)免疫沉淀（IP）-质谱鉴定心肌细胞中DYRK1A结合伙伴的工作流程示意图。(b)质谱分析中调节H3K4me3和H3K27ac富集的DYRK1A候选效应器的选择策略。(c（c）)WDR82（上图）和KAT6A（下图）的质谱图轮廓。显示了WDR 82和KAT6A肽的MS2光谱，并根据质量电荷比（m/z）绘制了肽片段的强度。(d日)验证DYRK1A与WDR82或KAT6A的相互作用，并确定负责结合的DYRJ1A域。通过共转染/co-IP实验检测HA标记的全长DYRK1A（泳道4）或其缺失突变体（N-末端结构域缺失，泳道5；激酶催化结构域缺失，泳道6；C-末端结构域缺失，泳道7）与FLAG标记的WDR82或KAT6A的结合。通道1，无转染对照；通道2，仅用DYRK1A转染进行对照。通道3控制，仅WDR82或KAT6A转染。TF：转染。IP：免疫沉淀。WB：western blot。(e（电子）)由DYRK1A调节WDR82和KAT6A的磷酸化。Co-IP分析用于显示DYRK1A敲除对WDR82和KAT6A磷酸化的影响。IP使用总磷酸化（Ser和Thr）抗体，免疫印迹使用WDR82或KAT6A抗体。干扰（si-NC）或DYRK1A-siRNA（si-DYRK1A）转染48小时后进行Co-IP(n个=每组6个样本）。显示了代表性免疫印迹（上部）和蛋白质水平定量（下部）。IP：免疫沉淀。⁎⁎⁎对与si-NC组相比<0.001。(（f）)免疫印迹法检测WDR82和KAT6A对DYRK1A对H3K4me3和H3K27ac整体变化的调节作用的影响(n个=每组6个样本）。此外，还显示了代表性免疫印迹（上部）和蛋白质水平定量（下部）。(⁎⁎对<0.01,⁎⁎⁎对<0.001）与si-NC组相比；###对与si-DYRK1A组相比<0.001。(克)WDR82和KAT6A对H3K4me3中DYRK1A调节作用的影响(第1组)和H3K27ac(g2型)细胞周期调控基因启动子的沉积。进行了ChIP-qPCR分析(n个=每组4个样本）。(小时)WDR82和KAT6A对DYRK1A在细胞周期调控基因表达中调节作用的影响。进行qPCR分析(n个=每组4个样本）。(i–k)Ki67-的免疫荧光染色和定量(我)，pH3-(j)和Aurkb-(k个)阳性心肌细胞显示WDR82或KAT6A敲除对DYRK1A在心肌细胞周期激活中的调节作用的影响。CMs：心肌细胞（每组四个独立实验中超过10000个心肌细胞）。(*对<0.05,⁎⁎⁎对<0.01,⁎⁎⁎对<0.001）与si-NC组相比；(#对<0.05时，##对<0.01,###对<0.001）与si-DYRK1A组相比。所有数据均表示为平均值±标准偏差。在e（电子）采用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验f–k.
图4
图4
对DYRK1A的抑制降低了心肌细胞中的KAT6A和WDR82磷酸化，从而诱导H3K27ac和H3K4me3修饰。(一)免疫沉淀（IP）-质谱鉴定心肌细胞中DYRK1A结合伙伴的工作流程示意图。(b)质谱分析中调节H3K4me3和H3K27ac富集的DYRK1A候选效应器的选择策略。(c（c）)WDR82（上图）和KAT6A（下图）的质谱图轮廓。显示了WDR 82和KAT6A肽的MS2光谱，并根据质量电荷比（m/z）绘制了肽片段的强度。(d日)验证DYRK1A与WDR82或KAT6A的相互作用，并确定负责结合的DYRJ1A域。通过共转染/共IP实验检测HA标记的全长DYRK1A（第4道）或其缺失突变体（N末端结构域缺失，第5道；激酶催化结构域缺失（第6道；C末端结构域删除，第7道）与FLAG标记的WDR82或KAT6A的结合。通道1，无转染对照；通道2，仅用DYRK1A转染进行对照。通道3控制，仅WDR82或KAT6A转染。TF：转染。IP：免疫沉淀。WB：western blot。(e（电子）)由DYRK1A调节的WDR82和KAT6A的磷酸化。Co-IP分析用于显示DYRK1A敲除对WDR82和KAT6A磷酸化的影响。IP使用总磷酸化（Ser和Thr）抗体，免疫印迹使用WDR82或KAT6A抗体。Co-IP在加扰（si-NC）或DYRK1A siRNA（si-DYRK1A）转染后48小时进行(n个=每组6个样本）。显示了代表性免疫印迹（上部）和蛋白质水平定量（下部）。IP：免疫沉淀。⁎⁎⁎对与si-NC组相比<0.001。(（f）)免疫印迹法检测WDR82和KAT6A对DYRK1A对H3K4me3和H3K27ac整体变化的调节作用的影响(n个=每组6个样本）。此外，还显示了代表性免疫印迹（上部）和蛋白质水平定量（下部）。(⁎⁎对<0.01,⁎⁎⁎对<0.001）与si-NC组相比；###对与si-DYRK1A组相比<0.001。(克)WDR82和KAT6A对H3K4me3中DYRK1A调节作用的影响(第1组)和H3K27ac(第二组)细胞周期调控基因启动子的沉积。进行ChIP-qPCR检测(n个=每组4个样本）。(小时)WDR82和KAT6A对DYRK1A在细胞周期调控基因表达中调节作用的影响。进行qPCR分析(n个=每组4个样本）。(i–k)Ki67-的免疫荧光染色和定量(我)，pH3-(j)和Aurkb-(k个)阳性心肌细胞显示WDR82或KAT6A敲除对DYRK1A在心肌细胞周期激活中的调节作用的影响。CMs：心肌细胞（每组四个独立实验中超过10000个心肌细胞）。(*对<0.05,⁎⁎⁎对<0.01,⁎⁎⁎对<0.001）与si-NC组相比；(#对<0.05,##对<0.01,###对<0.001）与si-DYRK1A组相比。所有数据均表示为平均值±标准偏差。在e（电子）采用单因素方差分析和Tukey的多重比较检验f–k.
图5
图5
DYRK1A的药理抑制促进成年心脏MI后的心脏修复。(一)实验设计示意图。将哈明以0.05 mg/ml的浓度溶于饮用水中。心肌梗死或假手术后，每隔7天进行一次超声心动图检查，直到心脏被切除。分别在第7天和第35天进行增殖和组织学分析。(b–d段)去氢骆驼蓬碱诱导的心肌细胞周期活性体内Ki67-的免疫荧光染色（左）和定量（右）(b)，pH3-(c（c）)和Aurkb-(d日)溶媒或去氢骆驼蓬碱处理的小鼠近梗死区心肌细胞呈阳性。Ki67-、pH3-和Aurkb-阳性心肌细胞用箭头表示。比例尺=40μm inb和c（c）; 标尺=20μm ind日CMs：心肌细胞（每组5只小鼠中>10000个心肌细胞）。⁎⁎⁎对与车辆组相比<0.001。(e–h)载药或去氢骆驼蓬碱处理成年小鼠心脏功能的超声心动图分析。显示了典型的M模式追踪图像（心肌梗死后第35天）和定量分析。LVEF：左室射血分数；LVFS：左心室缩短分数；左心室内径：收缩期左心室内径(n个=每组8只小鼠）。⁎⁎⁎对与车辆组相比<0.001。(我)在心肌梗死后第35天计算心脏重量与体重（HW/BW）的比值(n个=10).⁎⁎对与车辆组相比，<0.01。(j)代表性图片(j1公司)和量化(j2)心肌梗死后35天分离的心肌细胞的细胞大小。每个心脏随机选择80到100个细胞(n个=8). 比例尺为50µm。⁎⁎⁎对与车辆组相比<0.001。(k个)在心肌梗死后第35天测定每个心脏的游离心肌细胞总数(n个=8).⁎⁎⁎对与车辆组相比，<0.01。(我)溶媒或去氢骆驼蓬碱处理小鼠梗死心脏的纤维化区域。马森三色染色(l1级)和量化(二级)心肌梗死后第35天对心脏纤维化瘢痕进行连续横切，从心尖到动脉闭塞处间隔500μm。比例尺=1 mm(n个=每组5只小鼠）。⁎⁎⁎对与车辆组相比<0.001。所有数据均表示为平均值±SD。除（f）–小时，其中使用了单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。
图6
图6
图形摘要.DYRK1A磷酸化WDR82和KAT6A，以减少H3K4me3和H3K27ac在细胞周期基因启动子上的沉积，从而限制其转录激活并抑制心肌细胞的细胞周期活动。药物抑制或DYRK1A基因缺失均可促进成年心肌梗死后心肌细胞周期激活和心脏修复。
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