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.2022年8月8日；7（15）：e155010。
doi:10.1172/jci.insight.155010。

糖盏硫酸乙酰肝素裂解通过削弱剪切应激相关的AMPK/FoxO1信号传导促进内皮细胞血管生成素-2的表达

罗伯特·P·里希特 1 2 三, 阿米特·阿什特卡 1 三 4, 雷政 1 三 4, 丹妮尔·比勒托利斯 三 4, 特里帕提·考什伦德拉 5 6, 拉尔夫·D·桑德森 5 6, 阿米特·加加尔 2 7 8, 吉利安·里希特 三 4 9
附属公司

硫酸乙酰肝素糖裂解通过损伤剪切应力相关AMPK/FoxO1信号通路促进内皮细胞血管生成素-2的表达

罗伯特·P·里希特等。 JCI洞察力. .

摘要

血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）是脓毒症期间血管疾病的关键介质，血浆Ang-2水平升高与器官损伤评分和不良临床结局相关。我们之前已经观察到内皮细胞糖萼（EG）损伤的生物标记物与血浆Ang-2水平相关，这表明在全身炎症状态下EG损伤与Ang-2表达之间存在潜在的机制联系。然而，EG损伤后调节Ang-2表达的细胞信号机制尚不清楚。在当前的研究中，我们确定了作为EG侵蚀标志物的血浆硫酸乙酰肝素（HS）水平与脓毒症儿童和脓毒症小鼠模型中血浆Ang-2水平之间的时间相关性。其次，我们评估了剪切应力介导的5'-腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号在人原发性肺微血管内皮细胞（HLMVEC）表面酶促HS裂解后Ang-2表达中的作用。我们发现，脓毒症儿童和小鼠的血浆HS水平在血浆Ang-2水平之前达到峰值。此外，我们发现AMPK信号受损有助于血流调节HLMVEC HS裂解后Ang-2表达增加，建立了脓毒症期间Ang-2上调的范式。

关键词：内皮细胞；糖生物学；蛋白酶；血管生物学。

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利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。脓毒症患儿血浆HS水平在PICU入院时达到峰值，并与入院24小时后血浆Ang-2水平相关。
(A类)与健康对照组（HC）（对照组，n个= 39; 脓毒症，0小时和24小时n个=38，48小时n个=33，72小时n个= 30). **对<0.01，与对照组相比。(B类)与10名随机选择的对照组相比，10名脓毒症患者在PICU入院时的血浆肝素酶活性水平显著升高，与脓毒症儿童入院时血浆HS水平的升高相对应***对< 0.001. (C类)败血症儿童在PICU入院时（0小时）测得的血浆HS水平与PICU住院24小时后血浆Ang-2水平之间的Spearman等级相关性。数据以具有四分位范围的中位数表示，并通过普通的单向Kruskal-Wallis方差分析（经Dunn多重比较检验校正）进行分析(A类)或Mann-WhitneyU型测试(B类).
图2
图2。败血症小鼠血浆HS水平在血浆Ang-2之前升高。
(A类)C57BL/6J WT 12-14周龄雄性小鼠24小时血浆Ang-2水平(n个=3–4个/组）*对<0.05和***对<0.001，与车辆相比。(B类)IL-6和(C类)亚致死剂量注射LPS 0.1 mg/kg或等量注射0.9%无菌盐水后2小时和24小时小鼠血浆中的HS水平(n个=每组3人）**对< 0.01, ***对< 0.001. (D类)IL-6(E类)HS和(如果)基线检查时（盲肠结扎和穿孔前24小时）和CLP后4小时和24小时，C57BL/6J WT 12-14周龄雄性小鼠血浆中Ang-2水平(n个= 7). *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 所有数据均以平均值±SEM表示，并由普通(A类)或重复测量(D类–如果)通过Tukey多重比较测试或Student双面测试校正的单因素方差分析t吨测试(B类和C类).
图3
图3。流量调节HLMVEC改变HS分布并抑制ANG2型mRNA表达。
(A类)静态培养48小时（顶行）或15 dyn/cm后，叠加20倍原始放大共聚焦显微照片，显示HLMVEC上或中HS（10E4表位）、F-actin、β-catenin和细胞核（DAPI）的染色2（最下面一行）。比例尺：100μm。(B类)静态培养48小时（左侧）或15 dyn/cm后，叠加60倍原始放大共聚焦显微照片，显示HS相对于HLMVEC细胞边缘的分布（由β-catenin标定）2（右侧面板）（带有DAPI覆盖）。比例尺：20μm。(C类)在更换培养基后的24小时静态培养过程中，HLMVEC融合单层的上清液Ang-2水平（ELISA）(n个=每组4-8人）***对<0.001，而不是5分钟。(D类)相对HLMVECANG2型静态培养48小时后的基因表达(n个=9）或15达因/厘米2(n个= 10). ***对< 0.001. 所有数据均以平均值±SEM表示，并通过Tukey多重比较检验修正的单因素方差分析进行分析(C类)或学生的双面t吨测试(D类).
图4
图4。HLMVEC顶端表面的HS有助于调节ANG2型基因和Ang-2蛋白在流动条件下的表达。
(A类)流动调节HLMVEC（15 dyn/cm）上HS染色（10E4表位）的代表性20倍原始放大荧光图像2，48小时），然后再增加4小时15 dyn/cm2在没有（左面板）或有（右面板）200 mU/mL HepIII的情况下暴露（带DAPI覆盖）。比例尺：100μm。(B类)相对ANG2型流动调节HLMVEC中的基因表达（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm2在没有或存在HepIII 200 mU/mL的情况下再延长24小时(n个=每组5-8人）**对< 0.01. (C类)流动调节HLMVEC的相对上清液Ang-2水平（ELISA）（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm2在没有或存在HepIII 200 mU/mL的情况下再延长24小时(n个=每组4人）***对< 0.001. 所有数据均以平均值±SEM表示，并由学生的双面分析t吨测试(B类和C类).
图5
图5。流动调节HLMVEC的HS裂解降低剪切应力诱导的p-AMPK，促进Ang-2分泌。
(A类)静态培养48小时（顶部）或15 dyn/cm后对p-AMPK染色的HLMVEC代表性100倍原始放大荧光图像2（底部）（带DAPI覆盖）。比例尺：10μm。(B类)静态培养或15 dyn/cm后HLMVEC细胞质内p-AMPK的相对染色强度2（从8张代表性的40倍原始放大图像中，归一化为视野内的核数）***对< 0.001. (C类)流动调节HLMVEC中p-AMPK染色的代表性100×表观荧光图像（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm2在没有（顶部）或存在（底部）200 mU/mL HepIII的情况下再延长24小时（带DAPI覆盖）。比例尺：10μm。(D类)流动调节HLMVEC细胞质内p-AMPK的相对染色强度（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm2在没有或存在HepIII 200 mU/mL的情况下再延长24小时（从8张具有代表性的40倍原始放大图像中，归一化为视野内DAPI染色细胞核的数量）**对< 0.01. (E类)流动调节HLMVEC的相对上清液Ang-2水平（ELISA）（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm2和HepIII 200 mU/mL，在有或无AICAR 1 mM的情况下持续24小时**对< 0.01. 所有数据均以平均值±SEM表示，并由学生的双面分析t吨测试(B类,D类、和E类).
图6
图6。流动条件HLMVEC HS切割后AMPK活性降低可能通过FoxO1激活增加Ang-2表达。
(A类)相对FOXO1系列和KLF2号机组静态培养48小时或15 dyn/cm后HLMVEC的基因表达2(n个=每组3-4人）**对< 0.01, ***对< 0.001. (B类)相对FOXO1系列和KLF2号机组流动调节HLMVEC中的基因表达（15 dyn/cm2，48小时）暴露于15 dyn/cm的额外24小时2在没有或存在HepIII的情况下200 mU/mL(n个=每组3-4人）**对< 0.01. (C类)静态培养48小时（顶部）或15 dyn/cm后，对p-FoxO1染色的HLMVEC代表性100倍原始放大荧光图像2（底部）（带DAPI覆盖）。比例尺：10μm。(D类)静态培养或流动调节后HLMVEC细胞质中p-FoxO1的相对染色强度（来自8张代表性40倍原始放大图像，归一化为视野内的细胞核数量）***对< 0.001. (E类)流动调节HLMVEC在额外暴露于15 dyn/cm的24小时后，p-FoxO1染色的代表性100倍原始放大外荧光图像2在没有（顶部）或存在（底部）200 mU/mL HepIII的情况下（使用DAPI覆盖）。比例尺：10μm。(如果)再暴露15 dyn/cm 24小时的流动调节HLMVEC细胞质中p-FoxO1的相对染色强度2在不存在或存在HepIII 200 mU/mL的情况下（来自8张代表性的40倍原始放大图像，标准化为视野内的细胞核数量）**对< 0.01. p-AMPK的代表性100倍原始放大荧光图像(G公司)和p-FoxO1(H（H）)静态培养的HLMVEC经AICAR 1 mM或载体处理24小时后染色（DAPI覆盖）。比例尺：10μm。(我)相对ANG2型FoxO1抑制剂AS1842856或载体处理24小时后静态培养的HLMVEC中的基因表达(n个=每组4人）***对< 0.001. 所有数据均以平均值±SEM表示，并由学生的双面分析t吨测试(A类,B类,D类,如果、和我).
图7
图7。脓毒症期间HS从EG中切割降低AMPK信号传导从而促进Ang-2表达的拟议机制。
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