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.2022年6月3:13:857765。
doi:10.3389/分多.2022.857765。 eCollection 2022年。

FTO通过SLC7A11 m6A甲基化以铁凋亡依赖方式预防甲状腺癌进展

飞鸿基 1, 兴浩富 1, 李国权 1, 齐和 1, 新光球 1
附属公司

FTO通过SLC7A11 m6A甲基化以铁凋亡依赖方式预防甲状腺癌进展

飞鸿基等。 前内分泌（洛桑）. .

摘要

N6甲基腺苷（m6A）修饰是一种新的表观遗传调控机制，与肿瘤的遗传密切相关。同时，脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）有可能影响促进肿瘤进展的关键癌基因和抑癌基因mRNA m6A修饰的调节。在我们的研究中，甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的FTO下调。通过细胞计数试剂盒-8分析、细胞划痕、迁移、侵袭实验、流式细胞术凋亡分析和裸鼠实验评估FTO在PTC中的作用。除RNA-Seq和meRIP-Seq外，荧光素酶报告和突变分析还确定SLC7A11为潜在的FTO调节基因。此外，X射线电子显微镜、谷胱甘肽（GSH）/氧化型GSH、GPX、丙二醛测定和蛋白质印迹有助于证实FTO通过脱铁下调SLC7A11的表达来抑制PTC的发展。最后，通过拯救实验阐明FTO与其特异性靶基因SLC7A11的关系。FTO能够通过独立下调m6A中SLC7A11抑制PTC的发生，并在PTC中发挥抑癌基因的作用。这些发现有助于我们了解m6A调节的肿瘤恶性程度，并可能为甲状腺乳头状癌治疗的潜在生物标记物和治疗靶点提供新的见解。

关键词：FTO；SLC7A11；铁下垂；m6A；甲状腺乳头状癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
甲状腺乳头状癌（PTC）患者的脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）表达下调。（A）在癌症基因组图谱数据库中，甲状腺乳头状癌患者和正常人中FTO的表达。（B）RT-qPCR检测86对PTC标本中FTO的表达。（C）PTC患者标本中FTO免疫组织化学染色的代表性图像。
图2
图2
脂肪团和肥胖相关蛋白（FTO）抑制乳头状甲状腺癌（PTC）的增殖、迁移和侵袭在体外和体内.（A）构建TPC-1的FTO过表达模型和KTC-1的FTO沉默模型，并通过western blot进行验证。（B）用细胞增殖法评价FTO敲除或过表达的三种PTC细胞系的增殖能力。（C）创伤愈合分析显示，在FTO过度表达后，PTC细胞的迁移受到抑制，FTO分别被击倒或过度表达。相反，FTO敲除促进了PC细胞的迁移（伤口闭合）。（D）井间运移和侵入实验。（E）通过荧光激活细胞分选，FTO的过度表达显著增加了PTC细胞的凋亡。（F）异种移植小鼠模型中肿瘤大小的宏观图像，其中向小鼠注射对照细胞和KTC-1-shFTO细胞（稳定击倒FTO）。在原位异种移植小鼠模型中，FTO的敲除显著促进了PTC肿瘤的生长。*，P＜0.05。
图3
图3
脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）通过RNA-seq对乳头状甲状腺癌（PTC）细胞转录谱的影响。（A、B）火山图显示PTC-1载体细胞（对照）和PTC-1-Lv-FTO细胞（FTO过度表达）、logFC<-1或logFC>1之间的统计上调（红色）和下调（蓝色）基因，第页0.05，假发现率<0.05。（C）与上调和下调基因相关的信号通路揭示了差异表达基因在信号转导中的作用。（D）京都基因和基因组百科全书的分析表明，FTO过表达的调节途径参与细胞增殖、细胞周期和凋亡。（E）与PTC-1载体细胞（对照）和PTC-1-Lv-FTO细胞（FTO过度表达）之间上调和下调基因相关的基因本体论。
图4
图4
通过meRIP-Seq研究FTO对甲状腺乳头状癌（PTC）细胞转录谱的影响。（A）使用HOMER程序进行的基序分析表明，“GAACA”是TPC-1-vector和TPC-1-Lv-FTO细胞的m6A共有基序。（B，C）m6A-seq测量TPC-1细胞中m6A峰和基因的数量。（D、E）m6A峰值和读数分布图，说明TPC-1细胞中指示区域中常见m6A峰的比例。（F）峰值基因功能区中读数的分布图（和热图）。（G）与PTC-1载体细胞相比，PTC-1-Lv-FTO细胞m6A测序中m6A甲基化下调基因的京都基因百科全书和基因组分析。（H）与PTC-1载体细胞相比，PTC-1-Lv-FTO细胞m6A测序中m6A甲基化下调基因的基因本体分析。
图5
图5
RNA-seq和meRIP-seq结合RNA-seq揭示SLC7A11是脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）的靶点。（A）通过生物信息学分析筛选作为FTO下游靶点的SLC7A11。SLC7A11基因覆盖中的m6A位点。（B）EpiQuik™m6A RNA甲基化定量试剂盒用于确定m6A修饰是否在TMBIM6序列中富集。（C）通过meRIP-Seq测序，SLC7A11中的m6A峰。（D）在肺鳞癌细胞中沉默或过度表达FTO后，进行MeRIP分析以确定SLC7A11中m6A修饰富集的变化。（E）FTO抑制或过度表达后SLC7A11 mRNA的qRT-PCR分析。（F、G）荧光素酶报告实验证实，FTO的过度表达消除了TPC-1细胞中SLC7A11 mRNA的m6A修饰。*，P＜0.05。
图6
图6
SLC7A11被确定为甲状腺乳头状癌（PTC）的致癌驱动因素。（A）RT-qPCR检测86对PTC标本中SLC7A11的表达。（B）PTC患者标本中SLC7A11免疫组化染色的代表性图像。（C）western blot检测对照组和KTC-1-Lv-SLC7A11/TPC-1-shSLC7A11细胞中SLC7A1蛋白的表达。（D）CCK-8分析用于分析对照细胞和KTC-1-Lv-SLC7A11和TPC-1-shSLC7A11细胞的细胞活力。（E）划痕试验。SLC7A11基因敲除显著增加PTC细胞死亡并减弱迁移能力在体外.（F） 体外对照细胞和KTC-1-Lv-SLC7A11/TPC-1-shSLC7A11细胞的迁移和侵袭，通过跨孔分析进行评估。*，P＜0.05。
图7
图7
铁下垂在甲状腺乳头状癌中起重要作用。脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）通过介导SLC7A11的m6A甲基化来调节甲状腺乳头状癌（PTC）细胞脱铁。（A）通过western blot检测TPC-1-Lv-FTO、TPC-1-vector、TPC-1、KTC-1-shFTO、KTC1-scramble和KTC-1细胞中SLC7A11蛋白的表达。（B）采用Spearman秩相关系数分析PTC组织标本中FTO和SLC7A11 mRNA的表达。（C）透射电镜观察TPC-1-Lv-FTO细胞线粒体的超微结构。红色箭头，线粒体萎缩。标尺，2.0和5.0μm。细胞呈卵圆形，细胞膜完整连续，周围可见少量伪足，细胞质无明显水肿，细胞核规则，大致卵圆形，染色质分布均匀。线粒体固定，基质密度增加，嵴明显扩张，有脱铁迹象。粗面内质网轻度扩张，局部脱颗粒。细胞内可见少量自噬溶酶体。（D）western blot检测对照组和TPC-1-Lv-FTO/KTC-1-shFTO细胞中作为铁沉积生物标志物的NOX4、COX2、ACSL4、GPX4和FTH。（E）在指定的PTC细胞中测量谷胱甘肽（GSH）/氧化GSH比率*对< 0.05, **对<0.001。（F）丙二醛（MDA）分析用于评估氧化应激水平。测定所示PTC细胞中的MDA*对< 0.05, **对<0.001。（G）铁2+在指定的PTC细胞中测量*对< 0.05, **对<0.001。（H）在指定的PTC细胞中测量GPx*对< 0.05, **对<0.001。
图8
图8
SLC7A11的缺失可逆转脂肪量和肥胖相关蛋白抑制的作用。（A）CCK-8分析。（B）划痕试验。（C）跨井迁移和侵入分析*，P＜0.05。
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