Furin extracellularly cleaves secreted PTENα/β to generate C-terminal fragment with a tumor-suppressive role

doi:10.1038/s41419-022-04988-2

.2022年6月6日；13（6）:532。

doi:10.1038/s41419-022-04988-2。

Furin细胞外切割分泌的PTENα/β产生具有肿瘤抑制作用的C端片段

Cheng Zhang（张成）¹, 马宏明¹, 双树洞^1 2, Na Zhang（张娜）¹, 平和^三, 孟凯歌¹, 李霞¹, Jian Xiu余¹, 强霞^三, 陈国强^4 5, 邵敏申⁶

附属公司

¹中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。
²中国科学院中国科学院大学上海生物化学与细胞生物学研究所分子细胞科学卓越中心细胞生物学国家重点实验室，200031，中国上海。
^三肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，中国医学科学院研究室（NO.2019RU043），仁济医院，上海交通大学医学院，200127，中国上海。
⁴中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。chengq@shsmu.edu.cn。
⁵肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，中国医学科学院研究室（NO.2019RU043），仁济医院，上海交通大学医学院，200127，中国上海。chengq@shsmu.edu.cn。
⁶中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。smshen@shsmu.edu.cn。

PMID： 35668069
预防性维修识别码：项目经理C9170693
DOI（操作界面）： 10.1038/s41419-022-04988-2

Furin细胞外切割分泌的PTENα/β产生具有肿瘤抑制作用的C端片段

Cheng Zhang（张成）等。细胞死亡病. 2022.

.2022年6月6日；13（6）:532。

doi:10.1038/s41419-022-04988-2。

作者

Cheng Zhang（张成）¹, 马宏明¹, 双树洞^1 2, Na Zhang（张娜）¹, 平和^三, 孟凯歌¹, 李霞¹, Jian Xiu余¹, 强霞^三, 陈国强^4 5, 邵敏申⁶

附属公司

¹中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。
²中国科学院中国科学院大学上海生物化学与细胞生物学研究所分子细胞科学卓越中心细胞生物学国家重点实验室，200031，中国上海。
^三肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，中国医学科学院研究室（NO.2019RU043），仁济医院，上海交通大学医学院，200127，中国上海。
⁴中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。chengq@shsmu.edu.cn。
⁵肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，中国医学科学院研究室（NO.2019RU043），仁济医院，上海交通大学医学院，200127，中国上海。chengq@shsmu.edu.cn。
⁶中国教育部细胞分化与凋亡重点实验室病理生理学系，上海交通大学医学院瑞金医院，200025，中国上海。smshen@shsmu.edu.cn。

PMID： 35668069
预防性维修识别码：项目经理C9170693
DOI（操作界面）： 10.1038/s41419-022-04988-2

摘要

PTENα和PTENβ（PTENα/β）是10号染色体上磷酸酶和紧张素同源物（PTEN）的两种长翻译变体，发挥着与经典PTEN不同的作用，包括促进致癌和加速免疫耐受性癌症进展。然而，它们在致癌作用中的作用仍然非常未知。在此，我们报道，PTENα/β蛋白在分泌到细胞外空间后，在其N端延伸的多精氨酸伸展处，前蛋白转化酶Furin有效地将其切割成短的N端和长的C端片段。尽管分泌的PTENα/β及其裂解片段无法进入细胞，但对纯化的C末端片段而非PTENα裂解抗性突变体的治疗在体内发挥了抑瘤作用。因此，抗劈裂PTENα突变体的过度表达表现出比野生型PTENα更深刻的促肿瘤作用。与这些一致，与配对正常组织相比，肝癌组织中的C末端片段显著下调，这与Furin的下调表达一致。总之，我们表明细胞外PTENα/β与细胞内PTENα-β、，并提出PTENα/β的抑癌C末端片段可能作为外源性药物治疗癌症。

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数字

**图1。PTENα/β在其NTE内被裂解。**
A类,B类来源于*PTEN公司*-稳定表达EV、PTENα、PTENβ或PTEN的敲除SMMC-7721细胞(A类)以及在多西环素诱导表达系统的控制下诱导PTENα或PTENβ表达的SMMC-7721细胞(B类)对蛋白质进行Western blot检测，如图所示。(C类)体外培养的SMMC-7721细胞系及其4种异种移植物裂解产物的Western blot分析。D类N端子3×标记PTENα（3F-PTENα）的示意图（顶部）。体外培养物裂解液中指示蛋白的Western blot分析*PTEN公司*-稳定表达3F-PTENα的敲除SMMC-7721细胞系及其衍生的异种移植物（下图）。E类,F类异种移植物中指示蛋白的Western blot分析*PTEN公司*-稳定表达PTENα衍生物的敲除SMMC-7721细胞。EV，空向量；三 F、 3×标志。

**图2。PTENα在细胞外间隙被有效切割。**
A类来自表达PTENα-3F的SMMC-7721ΔPTEN细胞的异种移植物切片中抗Flag抗体免疫组化染色的代表性图像。比例尺，50 微米。B类细菌纯化的TrxA-S-tag-Flag或TrxA-S-tag-PTENα-Flag与293和293共培养 4个T或SMMC-7721细胞 SFCM中的小时数。对SFCM中的指示蛋白质进行蛋白质印迹分析。C类,D类293的WCL和SFCM中指示蛋白的Western blot分析转染EV或3F-PTENα的T细胞(C类)和PTENα-WT或PTENαΔ6 R在两端用3×旗帜标记(D类). 三 F3×Flag，WCL全细胞裂解物，SFCM无血清条件培养基。

**图3。PTENα被Furin裂解。**
A类细菌纯化的TrxA-S-tag-PTEN或TrxA-S-tag-PTEN-α（顶部）与293纯化的标记Furin孵育 T细胞，然后对所示蛋白质进行Western blot分析（底部）。星号指向两个未知带。B类PTENα与Furin在A中孵育，蛋白产物通过电泳分离并用考马斯亮蓝染色（顶部）。碎片^N个从凝胶上切下条带，用糜蛋白酶消化后进行质谱分析。红色箭头表示根据三种肽预测的呋喃裂解位点，并显示其串联质谱（底部）。C类qRT-PCR分析呋喃Furin蛋白mRNA（左）和Western blot分析*PTEN公司*-敲除SMMC-7721细胞，敲除或不敲除呋喃数据表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3个独立实验；双尾非配对t吨-使用测试*P（P）*显示的值）。D类表达3F-PTENα-3F的WCL和SFCM中指示蛋白的Western blot分析*PTEN公司*-敲除SMMC-7721细胞，敲除或不敲除呋喃.E类,F类表达3F-PTENα-3F的WCL和SFCM中指示蛋白的Western blot分析*PTEN公司*-敲除SMMC-7721细胞，用1 μM六-D-精氨酸(E类)以及V5标记的Furin的过度表达(F类).G公司293例共转染EGFP标记PTENα和mCherry-tagged Furin的代表性图像 T或*PTEN公司*-敲除SMMC-7721细胞并重新训练DAPI。比例尺代表10 微米。三 F 3×Flag，WCL全细胞裂解物，SFCM无血清条件培养基，NC阴性对照。

**图4。PTENα/β通过其NTE中的两种元素分泌。**
A类,B类293的WCL和SFCM中指示蛋白的Western blot分析表达3F-PTENα-3F衍生物或3F-PTENβ-3F的T细胞(A类)并指示PTENβ衍生物(B类).C类N146-EGFP融合蛋白示意图（顶部）。293中具有抗GFP抗体的指示蛋白的蛋白质印迹分析表达EGFP或N146-EGFP的T细胞（底部）。D类293个蛋白的Western blot分析表达EGFP或N146-EGFP衍生物的T细胞。E类293的WCL和SFCM中指示蛋白的Western blot分析表达PTENα衍生物的T细胞。WCL全细胞裂解物，SFCM无血清条件培养基，3 F 3×旗。

**图5。PTENα的C末端片段发挥抑瘤作用。**
A类考马斯蓝染色显示HSA和细菌纯化PTENα衍生物。B类,C类 *PTEN公司*-将敲除的SMMC-7721细胞皮下注射到裸鼠体内（1.5 × 10⁶每只老鼠的细胞数）。肿瘤达到约100 mm后^三在体积上，瘤内注射HSA和PTENα衍生物（10 μg/天，持续6天），并监测肿瘤体积(B类). 从每组中随机选择两个肿瘤进行蛋白质印迹分析(C类). B中的数据表示为平均值 ± 扫描电镜，n个 = 5个生物独立样本。通过双向方差分析确定统计显著性*P（P）*显示的值。D类——**H（H）** *PTEN公司*-表达EV或PTENα衍生物的敲除SMMC-7721细胞(D类)皮下注射到裸鼠体内（1.5 × 10⁶每只小鼠的细胞数）和不同天数的肿瘤体积（E）。皮下注射后第18天，采集肿瘤并拍照(F类)和加权(**G公司**)，从每组中随机选择两个肿瘤进行蛋白质印迹分析(**H（H）**). E和G中的数据表示为平均值 ± 扫描电镜，n个 = 6个生物独立样本。通过双向方差分析确定统计显著性(E类)和双尾不成对t吨-测试(**G公司**)带有*P（P）*显示的值。HSA人血清白蛋白，EV空载体。

**图6。肝癌组织中PTENα/β的裂解受到抑制。**
A类——C类对20例配对肿瘤和正常组织的肝癌样本进行蛋白质印迹分析(A类). 通过图像J量化印迹带的强度，并将其归一化为相应的β-肌动蛋白的强度，计算每个患者每种蛋白的T/N比率，并显示为聚集的热图(B类). PTENα/β裂解效率计算为Frag的比率^C类与总PTENα/β（Frag^C类+每个样本的全长PTENα/β），并对每个患者的肿瘤和正常组织进行比较(C类). 统计显著性由双尾配对确定t吨-使用测试*P（P）*显示的值。D类散点图分析呋喃TCGA LIHC和GEO GSE14520数据集中肿瘤组织和非肿瘤组织之间的表达。通过Mann-Whitney U检验（双侧）确定统计显著性*P（P）*显示的值。E类高表达或低表达呋喃TCGA LIHC和GEO GSE14520数据集的肿瘤组织中。统计显著性通过Log-rank检验（双侧）确定。

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1. Naderali E、Khaki AA、Rad JS、Ali Hemmati A、Rahmati M、Charoudeh HN。PTEN活性的调节和调节。分子生物学报告2018；45:2869–81。doi:10.1007/s11033-018-4321-6。-内政部-公共医学
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