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.2022年5月1日；18(8):3178-3193.
doi:10.7150/ijbs.69652。 eCollection 2022年。

裂解C5b-9通过PKC-α/p65/IRF-8轴诱导Thy-1N大鼠CCL3/4生成和巨噬细胞聚集

王文博 1, 钱宝美 1, 赵晨辉 2, 彭明宇 1, 刘龙飞 1, 谢梦晓 1, 那鹏（Na Peng） 三, 何庆龄 1, 帅英 1, 朱玉凤 4, 王涛（音译） 5, 胡大军 三, 丹·赵 1, 张静（音译） 1, 王英伟 1 6, 文丘 1 6
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裂解C5b-9通过PKC-α/p65/IRF-8轴诱导Thy-1N大鼠产生CCL3/4和巨噬细胞积聚

王文博等。 国际生物科学杂志. .

摘要

系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是一种常见的人类肾脏疾病。大鼠Thy-1肾炎（Thy-1N）是一种广泛用于MsPGN研究的动物模型。Thy-1N不仅是亚裂解C5b-9依赖性的，而且与大鼠肾组织中促炎细胞因子的产生和巨噬细胞（Mφ）的积累有关。在本研究中，我们发现Thy-1N大鼠肾组织中趋化因子CCL3/4、CD68（Mφ标记物）、IRF-8、PKC-α和NF-κB-65（p65）的表达或磷酸化均上调(体内)以及在亚细胞C5b-9刺激后的肾小球系膜细胞（GMC）中(在体外). 进一步的实验在体外发现磷酸化的PKC-α（p-PKC-β）可以促进p65磷酸化，然后p-p65通过与IRF-8启动子（-591~-582nt和-299~-290nt）的结合增强IRF-8的表达。此外，上调或沉默IRF-8基因可促进或减少CCL3/4的产生，进而调节Mφ趋化性。IRF-8与CCL3启动子（-249~-236 nt）结合导致CCL3基因转录的潜在机制。实验体内结果表明，肾脏PKC-α、p65、IRF-8和CCL3/4基因的敲除可抑制Thy-1N大鼠CCL3/4的产生、Mφ的积累、GMC的增殖和蛋白尿。此外，MsPGN患者肾组织中p-PKC-α、p-p65、IRF-8、CCL3/4的表达和Mφ的积累也增加。综上所述，这些发现表明亚溶化C5b-9通过PKC-α/p65/IRF-8轴诱导CCL3/4的产生和Mφ的积累，最终加重MsPGN的病理改变。

关键词：CCL3/4；IRF-8；Thy-1肾炎；巨噬细胞；系膜增生性肾小球肾炎；亚裂解C5b-9。

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数字

图1
图1
CCL3/4生产体内和在体外以及CCL3/4对Mφ趋化性的影响在体外.（A，B，D，E）用qPCR（A和D）和ELISA（B和E）检测不同时间点Thy-1N大鼠（A和B）肾组织和暴露于亚细胞C5b-9（D和E）的GMC中CCL3/4的mRNA和蛋白。*P<0.05，**P<0.01 vs.0h（C和F）CCL3/4在Thy-1N和NRS大鼠肾组织中的表达通过qPCR（C，mRNA在3h）和ELISA（F，蛋白质在6h）检测。**与NRS相比P<0.01。（G和H）大鼠GMC分为不同组，然后通过qPCR（G，mRNA在3小时时）和ELISA（H，蛋白质在6小时时）测定CCL3/4。**与其他组相比，P<0.01。（I和J）在使用或不使用CCL3/4中和抗体的亚溶化C5b-9处理后，用膜从含有GMC的下室中分离出含有Mφ的上室。通过transwell膜的结晶紫染色（放大倍率：×100）观察Mφ从上腔向下腔的趋化作用。**与IgG+亚溶血C5b-9相比，P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=3-5）。
图2
图2
IRF-1/6/8表达体内和在体外以及IRF-8在CCL3/4生产中的作用在体外.（A，B，D，E）通过qPCR（A和B）和IB（D和E）检测IRF-1/6/8在Thy-1N大鼠（A和D）肾组织和在不同时间点暴露于亚溶化C5b-9（B和E）的GMC中的表达。*P<0.05，**P<0.01 vs.0h（C和F）。用qPCR（C）和IB（F）检测3h Thy-1N和NRS大鼠肾组织中IRF-1/6/8的表达。*与NRS相比，P<0.05，**P<0.01。（G和H）将大鼠GMCs分为不同的组。治疗后3小时，通过qPCR（G）和IB（H）测定IRF-1/6/8的表达。**与其他组相比，P<0.01。（I-K）用pIRES2-IRF-8或pIRES2-EGFP转染大鼠GMC，转染后48 h用IB（I）、qPCR（J）和ELISA（K）检测IRF-8和CCL3/4的表达。*与pIRES2-EGFP相比，P<0.05，**P<0.01。（L-N）用shIRF-8或shCTR转染大鼠GMCs 48 h，然后亚溶C5b-9处理3 h。通过IB（L）、qPCR（M）和ELISA（N）检测IRF-8和CCL3/4的表达。**与shCTR+亚溶C5b-9相比，P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=3-5）。
图3
图3
IRF-8在亚细胞C5b-9刺激后GMC CCL3基因转录中的作用。（A） 用TFsearch预测CCL3基因启动子中的5个IRF-8结合元件。构建了FL和CCL3启动子的三个截短片段，包括pGL3-CCL3-FL、pGL3-CCL3-1（-453~+94nt）、pGL3-CCL3-2（-352~+94nt，pGL3-CC L3-3（-3~+94nt。（B） 将上述质粒和pRL-SV40转染到不同组的大鼠GMC中48 h，在亚细胞C5b-9刺激后3 h检测荧光素酶活性。**与FL或前两个截断组相比，P<0.01。（C） 将pIRES2-IRF-8、pGL3-CCL3-FL（或CCL3-1、CCL3-2、CCL3-3）和pRL-SV40的质粒转染到不同组的GMCs中，然后在转染后48小时检测荧光素酶活性。**与FL或前两个截断组相比，P<0.01。（D） 将pGL3-CCL3（FL或突变体）和pRL-SV40质粒转染到不同组的大鼠GMC中（48 h），并在亚溶化C5b-9培养后3 h测定荧光素酶活性。**与FL相比P<0.01。（E）将pIRES2-IRF-8、pGL3-CCL3（FL或突变型）和pRL-SV40质粒转染到不同组的GMC中，48小时后检测荧光素酶活性。**与FL（F-K）比较P<0.01。在质粒转染后48小时或亚溶化C5b-9治疗后3小时，用抗IRF-8抗体或IgG在不同组的GMC中富集DNA-IRF-8复合物。通过PCR（F，G，H）或qPCR（I，J，K）扩增CCL-3基因启动子的免疫沉淀DNA。*与MEM、pIRES2-EGFP或shCTR+亚溶化C5b-9相比，P<0.05，**P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=3）。
图4
图4
PKC-α和p65对GMC中IRF-8表达的影响。（A-C）分别将pIRES2-PKC-α-WT、pIRES2-PKC-γ-A25E和pIRES-2-PKC-β-K368R质粒转染GMC 48 h，然后通过IB（A）、qPCR（B）和ELISA（C）检测p-PKC-与pIRES2-EGFP相比，P<0.05，**P<0.01。（D-F）将pIRES2-PKC-α-WT、pIRES2-PKC-γ-A25E或pIRES-2-PKC-β-K368R质粒转染GMC 48 h，然后通过IB（D）、qPCR（E）和ELISA（F）检测p-PKC-与pIRES2 EGFP相比P＜0.01。（G-I）用shPKC-α、shp65或shCTR转染大鼠GMC 48 h，并与亚细胞C5b-9孵育3 h或6 h。IRF-8、CCL3和CCL4的表达通过IB（G，在3 h）、qPCR（h，在3小时）和ELISA（I，在6 h）检测。*与shCTR+亚溶化C5b-9相比，P<0.05，**P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=3）。
图5
图5
p65在暴露于亚细胞C5b-9的GMC中IRF-8基因转录中的作用。（A） 根据TFsearch软件预测的6个p65结合元件，构建了FL和IRF-8启动子的3个截短片段，即pGL3-IRF-8-FL、pGL3-IRF-8-1（-1360~+174nt）、pGL3-IRF-8-2（-752~+174 nt）和pGL3-IR F-8-3（-68~+174nt。（B） 将IRF-8-FL（或IRF-8-1、IRF-8-2、IRF-8-3）和pRL-SV40的萤光素酶报告质粒转染到不同组的GMCs中48小时，然后在亚裂解C5b-9后3小时测定萤光素酶活性。**与FL或前两个截断组相比，P<0.01。（C） 将pIRES2-p65-S535D和pGL3-IRF-8质粒（FL或截短片段）转染到不同组的GMC中，48小时后检测荧光素酶活性。**与FL或前两个消耗组相比，P<0.01。（D） 将pGL3-IRF-8（FL或突变体）和pRL-SV40质粒转染不同组的GMC 48 h，并在亚溶化C5b-9培养后3 h检测荧光素酶活性。**与FL相比P<0.01。（E）将pIRES2-p65-S535D、pGL3-IRF-8（FL或突变型）和pRL-SV40质粒转染到不同组的GMC中，48小时后测量荧光素酶活性。**与FL（F-H）相比，P<0.01。不同组（转染48 H或亚溶C5b-9刺激3 H）处理GMC，然后使用抗p65抗体或IgG纯化DNA-p65复合物。接下来，进行PCR，从免疫沉淀DNA中扩增IRF-8启动子片段。*与MEM、pIRES2-EGFP或shCTR+亚溶化C5b-9相比，P<0.05，**P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=3）。
图6
图6
敲除肾脏PKC-α、p65、IRF-8和CCL3/4基因可消除Thy-1N大鼠的Mφ数、GMC增殖、ECM蓄积和蛋白尿。注射LV-shPKC-α、LV-shp65、LV-shIRF-8和LV-shCCL3/4沉默靶基因，然后在LV注射后4d诱导肾炎。（A-C）用IB（A）、qPCR（B）和ELISA（C）检测大鼠肾组织中p-PKC-α、p-p65、IRF-8和CCL3/4的水平。（D-F）在LM（放大倍数，×400）下，通过IHC和h&E染色观察24小时大鼠肾小球中CD68阳性细胞的数量和7天肾小球总细胞的数量。此外，用EM评估第7天的GMC增殖和ECM积累。（G）检测第7天大鼠尿蛋白（mg/24h）。*与LV-shCTR+Thy-1N相比，P<0.05，**P<0.01。数据表示为平均值±SE（n=5）。（H） 我们展示的路径示意图。
图7
图7
MsPGN患者肾小球中p-PKC-α、p-p65、IRF-8、CCL3/4和CD68的表达。（A） 采用IHC染色法（放大倍数：×200）测定了p-PKC-α、p-p65、IRF-8、CCL3/4和CD68在MsPGN患者（n=20）和对照组（肾癌患者邻近组织，n=22）肾小球中的表达。（B-G）定量分析p-PKC-α（B）、p-p65（C）、IRF-8（D）、CCL3（E）、CCL 4（F）和CD68（G）的阳性细胞数或阳性面积。数据表示为平均值±标准偏差。**与对照组相比，P<0.01。
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