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。2022年4月15日；12(1):6263.
doi:10.1038/s41598-022-10176-1。

细胞内pH值影响用于细胞注射治疗的培养人角膜内皮细胞的线粒体稳态

德古奇（Hideto Deguchi） 1, 山下智子 1, Nao Hiramoto先生 1, 大冢洋平 1, Atsushi Mukai先生 1, 森宇野（Morio Ueno） 1, 奇·索托佐诺 1, 小岛茂 2, Junji Hamuro公司 3
附属公司

细胞内pH值对培养的人角膜内皮细胞线粒体稳态的影响

德古奇（Hideto Deguchi）等。 科学代表。 。

摘要

本研究旨在揭示全分化培养细胞细胞注射治疗临床疗效的机制。分析培养的人角膜内皮细胞（CECs）亚群（SP）上离子转运体的极化表达。测量了两个CEC-SP之间的细胞内pH（pHi），这两个CEC SP的分化细胞比例不同，并研究了其与线粒体呼吸稳态的关系。还探讨了选择性抑制剂或siRNA转染对离子转运体的抑制作用。纳+/K（K）+-ATPase、Aquaporin 1、SLC4A11、NBCe1、NHE1作为转运体和ZO-1均在分化的SP中选择性表达，但在细胞状态转换的SP中几乎为零。我们还证实，CEC SP的pHi通过抑制剂或siRNA转染调节这些离子转运体的表达，从而影响其线粒体呼吸。离子和水转运蛋白可能参与维持分化SP中pHi和线粒体的稳态，这可能与整体屏障功能结合，有助于有效的水流出。两种SP细胞内pH值的差异归因于特定离子转运体表达谱和线粒体功能的变化，这可能与SP在细胞注射治疗中的疗效有关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
分化SP和CST SP中离子和水转运蛋白的基因和蛋白表达。(一)离子和水转运蛋白的基因表达，ATP1A1、AE2、AQP1、NHE1和NBCe1。的级别ATP1A1、AE2、AQP1、NBCe1和NHE1标准化到GAPDH公司结果显示为2-ΔCt（相对表达单位）。(b条)一元羧酸转运蛋白的基因表达、MCT1、MCT4、和MCT8型.级别MCT1、MCT4，和MCT8型如上所述进行归一化。结果也显示为2-ΔCt（相对表达单位）。(c（c）)培养的CEC来自同一供体（两只眼睛，左右混合），并在10-µM Y27632（分化的SP、CD44）存在下培养-/+ 比例：86.7%）或10-µM Y27632 + 1-µM SB431542（SB4） + 10微米SB203580（SB2） + 5-ng/mL表皮生长因子（EGF）（CST SP，CD44-/+ 比例：0.9%）。两种CEC SP之间差异的显著性由Student’s评估吨-F测试确认后进行测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。
图2
图2
免疫荧光检测分化和CST-SP中的离子转运体和水转运体。纳+/K（K）+-ATP亚型ATP1A1、水转运蛋白Aquaporin 1、SLC4A11、碳酸氢盐转运蛋白NBCe1、Na+-H（H）+交换器NHE1和ZO-1作为补充液体运输的内皮屏障，均在分化的SP中选择性表达，但在细胞状态转换的SP中几乎为零。单羧酸转运蛋白4（MCT4）在前者中表达，但在后者中不表达，而异构体MCT1在后者中选择性表达，但不在前者中。从同一供体（两只眼睛，左右混合）获得分化的SP，并在10-µM Y27632（分化的SP、CD44-/ + 比例：86.7%）。CST-SP从单独的供体（两只眼睛，左右混合）中获得，并在10-µM Y27632的存在下培养 + 1-µM SB431542（SB4） + 10微米SB203580（SB2） + 5-ng/mL表皮生长因子（EGF）。分化后的SP固定在第二代第37天，CST SP固定在第二代第38天。棒材：100µm。实验重复了四次。
图3
图3
pHi的变化与培养中的分化以及分化后与CST-SP之间的pHi差异一致。饼图显示了两个CEC SP的比例，即差异化SP和CST-CEC SP。(一)在第7天、第14天、第28天、第42天和第49天（如上所述）监测培养期间pHi的变化，以及CD44的百分比 -/+ 细胞和CD44 ++/+++ 细胞（CST细胞）通过流式细胞术分析获得（如下）。CD44-/+SP比例的增加意味着分化已经在第14天左右开始。培养的CEC从同一供体获得，并在10µM Y27632存在下孵育。(b条)pHi随CD44不同比例的变化-/+ 表型。每个SP均取自同一供体，并与Y27632（①）、SB4、SB2和EGF（②）或SB4和EGF共同孵育。对于(一)和(b条); ( ×）标记表示pHi（n）的平均值==============================================================================12). 差异的重要性由Student’s吨-F测试确认后进行测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。
图4
图4
pHi受外部环境因素的调节。(一)20 mM氯化铵（NH）对pHi的影响4Cl）。将分化后的SP接种在96周的培养板上，培养6天，使其融合。0.4µL 5-M NH4向每个孔中添加Cl（最终浓度：20 mM），并测量pHi。（×）标记表示pHi（n）的平均值==============================================================================6). (b条)20-mM NH实时代谢分析4氯处理。将分化后的SP接种在XF24通量分析仪板上，并在37°C和5%CO中培养过夜20.2-mL PBS，含8µL 5 M NH4从XF24通量分析仪板中的培养基中替换Cl（最终浓度：20 mM）或仅PBS（对照），并在37°C和5%CO中培养2持续30分钟，然后用最小XF Dulbecco改良的Eagle培养基代替。(c（c）)分化和CST-SP之间的细胞外pH（pHe）变化。两种SP均来自同一供体。收集培养基并在5%CO中保持37°C后，使用pH计测量培养基的pH值2持续2小时。(d日)在分化SP中添加或不添加培养补充剂（EGF或SB4）后pHi发生变化。（×）标记表示pHi（n）的平均值==============================================================================6). 差异的重要性由Student’s吨-F测试确认后的测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。
图5
图5
离子转运体表达和pHi受转运体抑制剂调节。(一)抑制剂处理后pHi发生变化。在pHi测量前24小时，在6孔板分化SP中给药10-µM HMA（NHE1抑制剂）、S0859（NBCe1抑制剂）、syrosingopine（MCT1和MCT4抑制剂）或DMSO（1:500稀释）。(b条)NHE1处理的siRNA引起的pHi变化。根据制造商的说明，使用达摩FECT转染试剂，将分化后的SP转染NHE1的Silencer®Select siRNA（5 nM）或Silencer®Select阴性对照#1 siRNA，并培养24小时。( ×）标记表示pHi（n）的平均值==============================================================================6). 差异的重要性由Student’s吨-F测试确认后进行测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。
图6
图6
通过抑制离子转运体调节CECs线粒体呼吸。在实验前两天，将分化后的SP接种到XF24通量分析仪板上，并培养过夜；然后，用抑制剂（10-µM HMA、syrosingopine、S0859或1:500稀释的二甲基亚砜）处理每个孔。添加后24小时进行通量分析。实验至少重复两次。(一)HMA和syrosingopine治疗中OCR/ECAR的改变。备用呼吸容量（pmol/min/ × 1000个细胞/孔）HMA添加的CECs为8.17 ± 0.68对7.93 ± DMSO控制的0.15（p==============================================================================0.582），而6.89 ± 添加了0.59（p==============================================================================0.041) (b条)S0859治疗的OCR/ECAR改变。添加CEC的S0859的备用呼吸容量为12.05 ± 0.31对10.45 ± 0.28二甲基亚砜（p==============================================================================0.050). N个==============================================================================3用于(一)和5用于(b条). 差异的重要性由Student’s吨-F测试确认后进行测试。P（P） < 0.05被认为具有统计学意义。
图7
图7
CEC亚群的描述。总结了当前研究中两种分化的与CST-CEC SP的表型和功能特征，以及我们之前报告的结果–, ,“我们将两种SP之间细胞内pH的差异归因于特定离子转运蛋白和线粒体功能的表达谱变化；在分化的CEC中，NBCe1和NHE1等离子转运蛋白有助于维持中性的细胞内pH。分化后的SP也表达AQP-1和SLC4A11，用于水流出。然而，CST-SP缺乏这些离子转运体AQP-1和SLC4A11的表达，在水流出中不起作用，是细胞注射治疗中无效的内皮细胞。这里通过ZO-1的表达验证了屏障功能的完整性，ZO-1仅在分化的SP中表达，协同作用产生渗透梯度，从而导致有效的液体/水从基质流出到前房。请参阅正文中的详细讨论。”
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