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.2022年7月6日；20(7):1047-1060.
doi:10.1158/1541-7786.MCR-21-0477。

前列腺癌雄激素受体和OGT下游VPRBP对p53激活的抑制作用

尼努·普洛斯 1 2, 尼古拉斯·福赛特 1, 亚当·波伦斯基 三, 杰玛·格雷格 1, 莎拉·马奎尔 1, 马克·富克斯 1, 莎拉·明纳 三, 吉多·索特 三, 西蒙·麦克戴德 1, 伊恩·米尔斯 1 2
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前列腺癌雄激素受体和OGT下游VPRBP对p53激活的抑制作用

尼努·普洛斯等。 摩尔癌症研究. .

摘要

雄激素受体（AR）是前列腺癌发生和发展的主要驱动因素。O-GlcNAc转移酶（OGT）是一种催化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）与蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基共价加成的酶，通常在前列腺癌中高表达，其表达与高Gleason评分相关。在这项研究中，我们鉴定了一种AR和OGT共同调节因子，即Vpr（HIV-1）结合蛋白（VPRBP），也称为DDB1和CUL4相关因子1（DCAF1）。我们发现VPRBP在转录水平上受AR调节，在蛋白水平上受OGT稳定。前列腺癌细胞中VPRBP的敲除导致细胞增殖、p53稳定、核仁分裂和p53向染色质的募集显著减少。在人类前列腺肿瘤样本中，VPRBP蛋白过度表达与AR扩增、OGT过度表达、术后生化进展时间较短以及临床预后较差相关。在临床转录组数据中，VPRBP表达与AR呈正相关，也与AR活性基因特征呈正相关。

启示：总之，我们已经证明VPRBP/DCAF1在AR和OGT的影响下通过抑制p53激活来促进前列腺癌细胞增殖。

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数字

图1。将VPRBP确定为AR和O-GlcNAc共同调节的靶点。A、 Venn图显示了使用CEAS工具在星系池中生成的LNCaP AR ChIP-seq和O-GlcNAc ChIP-sec（LNCaP和PC3的共有位点）中与基因相关的峰值分布。B、 使用UCSC基因组浏览器在VPRBP启动子区富集AR和O-GlcNAc的ChIP-seq。“LNCaP_AR”是指1 nmol/L R1881处理的LNCaP（GSM696840）中的AR ChIP-seq结合位点。“LNCaP_veh_O-GlcNAc”是指经DMSO处理的LNCaP中的共识O-GlcNAc ChIP-seq–结合位点（来自GSM3076096、GSM3076997和GSM30760098）。“PC3_veh_O-GlcNAc”是指经DMSO处理的PC3中的共识O-GlcNAc ChIP-seq–结合位点（来自GSM3586373、GSM35863、GSM358、375）。C、 CAMKK2和VPRBP与AR ChIP的回收率；以及PPAT/PAICS和VPRBP，其中O-GlcNAc ChIP存在于载体中（0.01%乙醇），1 nmol/L R1881 4-和24小时处理的LNCaP细胞（n=1）。D、 qRT-PCR检测VPRBP、CAMKK2和UAP1 mRNA在经载体或1 nmol/L R1881处理24小时的LNCaP中的表达。结果归一化为RPLPO，作为内务管理控制（n=3）。E、 不同时间点暴露于1 nmol/L R1881后VPRBP表达的时间依赖性。LNCaP细胞在用载体或1 nmol/L R1881刺激前3天被雄激素剥夺。学生t检验的P值。**，P<0.01；***，P<0.001。
图1。
将VPRBP确定为AR和O-GlcNAc共同调节的靶点。A、，Venn图显示了使用CEAS工具在星系池中生成的LNCaP AR ChIP-seq和O-GlcNAc ChIP-sec（LNCaP和PC3的共有位点）中与基因相关的峰值分布。B中，ChIP-seq富集AR和O-GlcNAcVPRBP公司启动子区使用UCSC基因组浏览器。“LNCaP_AR”是指1 nmol/L R1881处理的LNCaP（GSM696840）中的AR ChIP-seq结合位点。“LNCaP_veh_O-GlcNAc”是指载体（DMSO）处理的LNCaP中的共有O-GlcNAc-ChIP-seq结合位点（来自GSM3076096、GSM3076097和GSM3076098）。“PC3_veh_O-GlcNAc”是指经DMSO处理的PC3中的共识O-GlcNAc ChIP-seq–结合位点（来自GSM3586373、GSM35863、GSM358、375）。C、，CAMKK2和VPRBP与AR ChIP的回收率；以及PPAT/PAICS和VPRBP与载体中的O-GlcNAc-ChIP（0.01%乙醇）和1 nmol/L R1881 4和24小时处理的LNCaP细胞(n个= 1).D、，qRT-PCR检测VPRBP、CAMKK2和UAP1 mRNA在经载体或1 nmol/L R1881处理24小时的LNCaP中的表达。结果作为内务管理控制归一化为RPLPO(n个= 3).E、，不同时间点暴露于1 nmol/L R1881后VPRBP表达的时间依赖性。LNCaP细胞在用载体或1 nmol/L R1881刺激前3天被雄激素剥夺。对按学生列出的值t吨测试**，对< 0.01; ***,对<0.001。
图2。VPRBP稳定性需要OGT。A、 将OGT siRNAs瞬时转染LNCaP细胞，转染后5天采集细胞，通过免疫印迹分析检测基础条件下的蛋白表达。B、 为了检测雄激素刺激条件下的蛋白表达，在1 nmol/L R1881刺激24小时之前，用OGT siRNA或干扰siRNA（scr-si）转染LNCaP细胞，然后去除雄激素72小时。C、 在0至8小时内进行环己酰亚胺（50µg/mL）追踪实验，以评估OGT击倒（72小时）对VPRBP降解的影响。D、 用RL2抗体免疫印迹法（IB）检测LNCaP细胞IP-VPRBP的O-GlcNA酰化。E、 从LNCaP细胞质提取物中检测到O-GlcNAcylated VPRBP。在下拉（输入）和捕获蛋白（洗脱）之前，用VPRBP抗体和阳性对照G6PD对裂解液进行免疫印迹（IB）。在没有GalT的对照实验中，显示了在VPRBP和G6PD上选择性标记O-GlcNAcylation。F、 通过免疫印迹分析检测OGT抑制剂40µmol/L OSMI2和10µmol/L OSMI3对24小时治疗后VPRBP蛋白水平的影响。G、 免疫印迹分析OGT敲除对22Rv1细胞VPRBP蛋白表达的影响。
图2。
VPRBP稳定性需要OGT。A、，将OGT siRNAs瞬时转染LNCaP细胞，转染后5天采集细胞，通过免疫印迹分析检测基础条件下的蛋白表达。B中，为了检测雄激素刺激条件下的蛋白表达，在1 nmol/L R1881刺激24小时之前，用OGT siRNA或干扰siRNA（scr-si）转染LNCaP细胞，然后去除雄激素72小时。C、，在0至8小时内进行环己酰亚胺（50µg/mL）追踪实验，以评估OGT击倒（72小时）对VPRBP降解的影响。D、，用RL2抗体免疫印迹法（IB）检测LNCaP细胞IP-VPRBP的O-GlcNA酰化。E、，从LNCaP细胞质提取物中检测到O-GlcNAcylated VPRBP。在下拉（输入）和捕获蛋白（洗脱）之前，用VPRBP抗体和阳性对照G6PD对裂解液进行免疫印迹（IB）。在没有GalT的对照实验中，显示了在VPRBP和G6PD上选择性标记O-GlcNAcylation。F、，通过免疫印迹分析检测OGT抑制剂40µmol/L OSMI2和10µmol/L OSMI3对24小时治疗后VPRBP蛋白水平的影响。G、，免疫印迹分析OGT敲除对22Rv1细胞VPRBP蛋白表达的影响。
图3。VPRBP敲除导致细胞增殖减少和p53稳定。A、 用VPRBP siRNA转染LNCaP细胞，转染后3天采集细胞，检测VPRBP、OGT、p53和p21的mRNA表达（n=4）。B、 通过转染后5天的细胞计数来评估VPRBP敲低对LNCaP细胞增殖的影响；细胞在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n=4）的条件下生长。C、 通过对转染后3天制备的细胞裂解物进行免疫印迹分析，评估VPRBP敲除对LNCaP p53、细胞周期标记物和其他相关蛋白的影响。D、 通过在存在（CM）和不存在雄激素（ADM；n=4）的情况下生长的TP53敲除（KO）LNCaP细胞中的细胞计数来评估VPRBP敲除对细胞增殖的影响。E、 通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对LNCaP和TP53-KO LNCaP-相关蛋白的影响。F、 在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n=3）的情况下生长的VCaP细胞转染5天后，通过细胞计数来评估VPRBP敲除对细胞增殖的影响。G、 通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对相关VCaP蛋白的影响。结果表示为平均值±标准偏差*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.00。统计分析采用Student t检验进行qPCR和单向方差分析，然后进行Tukey事后细胞增殖分析。
图3。
VPRBP敲除导致细胞增殖减少和p53稳定。A、，用VPRBP siRNA转染LNCaP细胞，转染后3天采集细胞，检测VPRBP、OGT、p53和p21的mRNA表达(n个= 4).B中，转染后5天通过细胞计数评估VPRBP敲除对LNCaP细胞增殖的影响；细胞在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM）的条件下生长；n个= 4).C、，通过对转染后3天制备的细胞裂解物进行免疫印迹分析，评估VPRBP敲除对LNCaP p53、细胞周期标记物和其他相关蛋白的影响。D、，通过在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n个=4）。E、，通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对LNCaP和TP53-KO LNCaP-相关蛋白的影响。F、，在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n个= 3).G、，通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对相关VCaP蛋白的影响。结果表示为平均值±标准偏差*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001. 统计分析由Student执行t吨Tukey进行qPCR和单向方差分析测试事后（post-hoc）细胞增殖分析。
图4。VPRBP敲除增加p53染色质募集并诱导核仁应激。A、 显示不同转染条件下p53 ChIP后p21和阴性位点引物（CCND1）回收率的条形图（n=1）。B、 表中显示了在不同条件下获得的峰数。C、 文氏图显示了我们在LNCaP细胞中的nutlin-3a p53 ChIP-seq与之前报道的MCF7细胞中的nutlin-3a-p53 ChIP-seq的重叠（GSE86164）。D、 维恩图显示LNCaP中nutlin-3a p53 ChIP-seq与VPRBPsi p53 ChIP-seq共识位点的重叠。E、 Venn图显示了MCF7细胞中VPRBPsi p53 ChIP-seq共有位点与先前报道的nutlin-3a p53 ChIP-seq的重叠。F、 显示VPRBP相互作用组与核仁蛋白质组重叠的维恩图。G、 典型的免疫荧光图像显示转染后3天，打乱和转染VPRBP siRNA的LNCaP中VPRBP和纤维蛋白染色（比例尺，10µm）。
图4。
VPRBP敲除增加p53染色质募集并诱导核仁应激。A、，显示不同转染条件下p53 ChIP后p21和阴性位点引物（CCND1）回收率的条形图(n个= 1).B中，表中显示了在不同条件下获得的峰数。C、，文氏图显示了我们在LNCaP细胞中的nutlin-3a p53 ChIP-seq与之前报道的MCF7细胞中的nutlin-3a-p53 ChIP-seq的重叠（GSE86164）。D、，维恩图显示LNCaP中nutlin-3a p53 ChIP-seq与VPRBPsi p53 ChIP-seq共识位点的重叠。E、，Venn图显示MCF7细胞中VPRBPsi p53 ChIP-seq共识位点与之前报道的nutlin-3a p53 ChIP-seq重叠。F、，显示VPRBP相互作用组与核仁蛋白质组重叠的维恩图。G、，典型的免疫荧光图像显示转染后3天，打乱和转染VPRBP siRNA的LNCaP中VPRBP和纤维蛋白染色（比例尺，10µm）。
图5。VPRBP蛋白表达与AR扩增、OGT过度表达和不良预后相关。在TMA切片中，通过IHC显示VPRBP表达与AR（A）和OGT表达（B）正相关的条形图。C、 在有或无VPRBP表达的低或高AR表达患者中，PSA无复发生存曲线；在无、低或高OGT表达的患者中，VPRBP存在或无表达的生存曲线（D）。E、 TCGA胰腺癌图谱前列腺数据集中AR mRNA表达与VRPBP mRNA表达的散点图比较。F、 盒子图显示VPRBP表达四分位数与139个来自heatmap上调的AR基因之间的关联。
图5。
VPRBP蛋白表达与AR扩增、OGT过度表达和不良预后相关。显示VPRBP表达与AR正相关的条形图(A类)和OGT表达式(B类)由IHC在TMA部分进行。C、，表达低或高AR水平且VPRBP表达存在或缺失的患者的PSA无复发生存曲线和生存曲线(D类)在无OGT、低OGT或高OGT的患者中，VPRBP表达存在或不存在。E、，TCGA胰腺癌图谱前列腺数据集中AR mRNA表达与VRPBP mRNA表达的散点图比较。F、，盒子图显示VPRBP表达四分位数与139个来自heatmap上调的AR基因之间的关联。这个对-中的值C类和D类指出总体意义。
图6。VPRBP表达与p53活性特征呈负相关。A、 比较TCGA PanCancer Atlas前列腺数据集中GSEA Hallmark“P53通路”和VRPBP mRNA表达的散点图。B、 显示泰勒数据集中VPRBP表达与p53子代评分的散点图。C、 方框图显示了来自热图的VPRBP表达四分位数和127个下调的Fischer-p53直接结合基因之间的关联。D、 qPCR检测VPRBP敲除对LNCaPs中p53靶基因的影响（n=3）。E、 qPCR检测VPRBP敲除对TP53-KO LNCaPs中p53靶基因的影响（n=3）。结果以平均值±标准差*表示，P<0.05；**，P<0.01；***，经Student t检验，P<0.001。
图6。
VPRBP表达与p53活性特征呈负相关。A、，比较TCGA PanCancer Atlas前列腺数据集中GSEA Hallmark“P53通路”和VRPBP mRNA表达的散点图。B中，显示泰勒数据集中VPRBP表达与p53子代评分的散点图。C、，方框图显示VPRBP表达四分位与热量图中127个下调Fischer p53直接结合基因之间的关联。D、，qPCR检测VPRBP敲除对LNCaPs中p53靶基因的影响(n个= 3).E、，qPCR检测VPRBP敲除对TP53-KO LNCaPs中p53靶基因的影响(n个=3）。结果表示为平均值±标准偏差*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对<0.001（学生）t吨测试。
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