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.2022年6月；82(9):957-969.
doi:10.1002/pros.24342。 Epub 2022年3月25日。

前列腺癌中PLK4上调，其抑制减少中心体扩增并导致衰老

钱德拉·K·辛格 1, 瑞安·A·德努 2 三 4, 米纳克什·尼哈尔 1, 玛丽亚·沙比尔 1, 黛布拉·加维 1, 魏黄 5, 肯尼思·阿伊茨科夫斯基 6, 尼哈尔·艾哈迈德 1 4 7
附属公司

前列腺癌中PLK4上调，其抑制减少中心体扩增并导致衰老

钱德拉·K·辛格等。 前列腺. 2022年6月.

摘要

背景：确定新的分子靶点对于设计新的机械驱动方法治疗前列腺癌（PCa）非常重要，前列腺癌是男性发病率和死亡率的主要原因之一。在这项研究中，我们确定了polo-like kinase 4（PLK4）在前列腺癌中的作用，它调节中心粒复制和中心体扩增（CA）。

材料和方法：利用人类PCa组织微阵列，我们评估了CA的患病率，与Gleason评分相关，并通过对母亲/成熟中心粒的染色来估计PCa中CA的主要原因（细胞加倍与中心粒过度复制）。我们还评估了PLK4的表达，并将其与人类PCa组织和细胞系中的CA相关联。此外，我们还测定了PLK4抑制对人PCa细胞的影响。

结果：与良性前列腺相比，人类前列腺癌表现出显著更高的CA，这也与Gleason评分呈正相关。此外，发现大多数CA病例是由PCa中心粒过度复制引起的，而非细胞加倍事件（如胞质分裂失败）。此外，PLK4在人类PCa细胞系和肿瘤中过度表达。此外，PLK4抑制剂CFI-400945和中心蛋白B抑制雄激素应答和雄激素依赖性PCa细胞系的细胞生长、活性和集落形成。PLK4抑制也可诱导人PCa细胞的细胞周期阻滞和衰老。

结论：CA在PCa中普遍存在，主要由中心粒过度复制引起，而不是细胞加倍事件。中心粒丢失是细胞应激，可促进衰老，提示抑制PLK4可能是PCa的可行治疗策略。

关键词：CFI-400945；PLK4；中心粒过度重复；中心体；前列腺癌。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
中心体扩增发生在PCa中，与较高的Gleason评分相关，且主要由中心粒过度复制引起。（A） 前列腺癌（左侧）和前列腺良性标本（右侧）中心体（中心蛋白，绿色）的显微照片。组织也染色细胞角蛋白（红色）和DNA（蓝色）。白色箭头表示PCa图像中间的有丝分裂细胞。比例尺 = 10 微米。（B） 绘制每个肿瘤和良性样本的平均中心体数（由中心蛋白病灶评估）。每个样本的单个细胞数据如图S1A所示。（C） CA定义为一个细胞内>2个中心蛋白病灶。每个肿瘤中至少有50个细胞被评估。每个点代表一个PCa或良性标本。（D） 每个细胞的平均心室周围病灶与Gleason评分的相关性。（E） 具有>2个中心蛋白病灶的细胞百分比与Gleason评分的相关性。（F，G）PCa中的周中心蛋白（绿色）和CEP164（红色）染色显微图显示周中心蛋白和CEP154的低重叠（F）或高重叠（G），表明CA分别是通过中心粒过度复制或细胞加倍。圆心蛋白 = 绿色，CEP164 = 红色和DNA/DAPI = 蓝色。比例尺 = 5 微米。（H） 比较中心体百分比（由中心粒染色定义）的点图，该百分比与母亲/成熟中心粒标记（CEP164）一致。每个点表示一个肿瘤/样本中细胞的平均值。（一） 进一步分析每个PCa内的细胞和具有>2个中心蛋白病灶（CA）的增生标本，以确定这些细胞中CA的原因。点图显示了这些细胞中与CEP164（黑色轮廓方框）共染色的中心蛋白病灶的百分比。为了进行比较，还显示了PCa和增生标本（黑色圆圈）中具有1-2个中心蛋白病灶的细胞与CEP164共染的中心蛋白病灶百分比。良性标本仅显示非CA细胞，因为患有CA的细胞数量非常少。每个点代表每个样本的平均值。每个样本的单个细胞数据如图S1B所示。（J） 与CEP164相关的中心体百分比与肿瘤的Gleason评分相比较。在所有面板中，条形代表平均值 ± 标准偏差*第页 < 0.05和***第页 < 0.001. CA，中心体扩增；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；前列腺癌。[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
图2
图2
PLK4在人类PCa中过度表达，其过度表达与较差的生存率相关。（A） PCa和良性前列腺标本的代表性显微照片显示PLK4免疫染色。使用PLK4抗体和ABC碱性磷酸酶试剂对TMA#PR956（US Biomax）进行免疫染色，然后与载体红染色原孵育，然后苏木精作为核染色。图像以20倍放大率拍摄。使用Nuance软件放大虚线区域。（B） 使用Vectra系统扫描PLK4染色载玻片，并使用inForm软件分析PLK4光密度（OD），以测量每个组织核心中的染色。绘制了图表并t吨测试用于统计比较。（C） PLK4水平也根据PCa中的Gleason等级绘制。接下来，利用TCGA提供的生存数据，根据497例前列腺癌患者的PLK4 mRNA表达，分析（D）无病生存率（DFS）和（E）总生存率（OS）；cBioPortal（33）用于查询数据。PLK4 mRNAZ轴0分被用作“低”与“高”PLK4表达的分界点。（F） 基于Gleason评分的PLK4表达水平。（G，H）CA20按照Ogden等人的描述进行计算。CA20包含第4页随着奥卡,CCNA2号机组,CCND1号机组,CCNE2公司,CDK1型,CEP63公司,CEP152号机组,E2F1系列,E2F2型,LMO4型,MDM2型,MYCN公司,国家发改委1,NEK2公司,PIN码1,PLK1,萨斯6,STIL公司，以及管1基因。使用CA20评分中位数将患者分为两组。采用Kaplan–Meier方法绘制存活曲线第页生存曲线上显示的值通过对数秩检验确定。（一） 基于格里森得分的CA20得分。方差分析用于面板（C、F和I）中各组的统计比较，条形代表平均值 ± 标准偏差*第页 < 0.05; **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001. ABC，抗生物素/生物素复合物；方差分析；CA20，中心体扩增20；mRNA、信使RNA；前列腺癌；PLK4，polo样激酶4；TMA，组织芯片。[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
图3
图3
PLK4过度表达与PCa细胞系中的CA相关，并被PLK4抑制所逆转。（A） 与正常前列腺上皮细胞（HPrEC）相比，PCa细胞系（DU145、22Rν1、PC3、LNCaP和C4‐2）中PLK4和肌动蛋白的免疫印迹（B）免疫印迹中蛋白质带的定量（PLK4:actin的比率）。横线代表平均值 ± SD来自三个斑点。（C） PCa细胞系中PLK4与HPrEC的RT-qPCR分析。GAPDH公司被用作内生控件。（D） 每个前列腺细胞系中心粒的定量。（E） 绘制每个细胞系中CA细胞的百分比（定义为>4个中心蛋白焦点）。（F） 前列腺细胞系中PLK4蛋白和mRNA水平的相关性。皮尔逊第页 = 0.513,第页 = 0.298. （G） 免疫印迹显示中心粒与PLK4蛋白表达的相关性。（H） 中心粒与PLK4 mRNA的相关性。（I）HPrEC细胞表现出中心粒过度复制（中心粒与母中心粒的比例低；由PLK4过度表达诱导）和细胞加倍（中心粒和母中心粒比例高；由细胞松弛素D诱导）的例子。比例尺 = 10 微米。（J） 用中心蛋白和CEP164染色的前列腺细胞系的代表性图像。比例尺 = 10 微米。（K） 用CEP164定量中心粒百分比。每个点代表一个单元格。（五十） 用CFI‐400945（50 48 nM h） 或centrinone‐B（50、100或500 48 nM h） ●●●●。每个点表示一个单元格。横线代表平均值 ± SD和统计显著性表示为*第页 < 0.05; **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001. CA，中心体扩增；HPrEC，人原代前列腺上皮细胞；前列腺癌；PLK4，polo样激酶4；RT-qPCR，逆转录定量实时PCR。[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
图4
图4
使用小分子抑制剂CFI‐400945抑制PLK4可显著降低人类PCa细胞的细胞生长、活力和集落形成。（A，B）PCa细胞在特定浓度的CFI‐400945（0，25，50，100）下处理 nM）72 h、 然后使用台盼蓝排除试验进行细胞生长和活力分析。数据通过GraphPad Prism 5软件进行分析，使用单向方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试。数据以平均值表示 ± 具有统计意义的SEM(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001). 统计显著性代表了所有PCa细胞系在特定CFI‐400945浓度下与HrPEC相比的显著性（除了DU145细胞在25 nM，这并不重要）。（C） 对于集落形成分析，PCa细胞被处理72 在规定浓度下使用CFI‐400945。然后收集这些处理过的细胞，将其等量（500个细胞）重新放置在六孔板中，并允许其生长约2周。菌落用1%结晶紫染色，洗涤，风干，然后进行数字摄影。CA，中心体扩增；二甲基亚砜；前列腺癌；PLK4，polo样激酶4。[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
图5
图5
CFI‐400945对PLK4的抑制可诱导人PCa细胞G2/M期细胞周期阻滞和衰老样表型。（A–E）PCa细胞系DU145、22Rν1、PC3、LNCaP和C4-2用CFI‐400945处理，用碘化丙啶染色，并用流式细胞术进行分析。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较测试对数据进行分析，并以平均值表示 ± 具有统计意义的SEM(**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001）用于G2/M细胞周期阻滞。（F） 用CFI‐400945处理HPrEC和PCa细胞系，并对其进行β‐半乳糖苷酶染色。呈现了每个治疗组在40倍放大率下的代表性图像。（G） 在四个不同的领域对SA‐β‐Gal‐阳性细胞进行评分。结果表示为SA‐β‐Gal‐阳性细胞的平均百分比（平均 ± SEM）。PCa细胞中（H，I）CDKN1A（p21）mRNA和蛋白水平。GAPDH公司用作的内生控件CDKN1A公司mRNA分析。文库林被用作蛋白质负载对照。数据代表三个生物复制。方差分析；CA，中心体扩增；二甲基亚砜；HPrEC，人原代前列腺上皮细胞；mRNA、信使RNA；前列腺癌；PLK4，polo样激酶4；SA‐β‐Gal，衰老相关β‐半乳糖苷酶。[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
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