跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2022年3月17日；13(1):1426.
doi:10.1038/s41467-022-29075-0。

保守发育转录因子调控中脑多巴胺能神经元线粒体完整性的维持

费德里科·米奥佐 1 2, 伊娃·P·瓦伦西亚-阿拉科 1, 卢卡·斯特克利 1, 米夏·拉·马吉辛·多西科娃 1, 弗朗西斯科·彼得雷利 三, 达姆拉·塔斯 1 4, 尼古拉斯·隆克 1 5, 伊琳娜·尼科内科 6, 彼得·布迪布 7, 艾米·长治 8
附属公司

保守发育转录因子调控中脑多巴胺能神经元线粒体完整性的维持

费德里科·米奥佐等人。 国家公社. .

摘要

黑质多巴胺能（DA）神经元的进行性变性是帕金森病（PD）的特征。发育转录因子的失调与多巴胺能神经退行性变有关，但其潜在的分子机制尚不清楚。果蝇Fer2是中脑DA神经元的产生和维持所需的发育转录因子的主要例子。通过将ChIP-seq、RNA-seq和遗传上位性实验与PD-linked基因相结合的方法，我们证明Fer2控制转录网络以维持线粒体结构和功能，从而赋予多巴胺能神经保护以抵抗遗传和氧化损伤。我们进一步表明，在分化的DA神经元中，对Fer2的小鼠同源物Nato3进行条件性消融会导致老年小鼠线粒体异常和运动障碍。我们的结果揭示了Fer2同源物在中脑DA神经元线粒体维持中的基本和保守作用，为PD的建模和治疗开辟了新的视角。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。第2学期过度表达可防止帕金森病遗传模型中PAM多巴胺能神经元的丢失和线粒体功能障碍。
一,b条 第2学期过度表达可防止野生型靶向表达诱导的PAM神经元的丢失(重量)或致病性突变勒克PAM神经元。一第14天PAM神经元的代表性图像由抗TH抗体检测（绿色）。PAM公司，PAM神经元特异性R58E02-GAL4型驱动程序。PAM公司 > X（X）表示UAS-转基因X由以下因素驱动R58E02-GAL4型.比例尺，20 微米。左上角是PAM（绿色）和其他簇（黑色）中DA神经元的示意图。b条TH数量的量化+每半球PAM神经元(一).n个 = 每组16个半球**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001.PAM公司与。PAM公司 > Lrrk重量,第页 = 0.0026.PAM公司与。PAM公司 > Lrrk I1915T公司,第页 = 0.0002.PAM公司 > Lrrk I1915T公司与。PAM公司 > Lrrk I1915T，Fer2,第页 = 0.0001. ns，不显著。单因素方差分析（ANOVA），然后进行多组比较的Tukey检验。c第14天PAM神经元的代表性图像标记为PAM公司 > 红色毒刺.比例尺，20 微米。d日红色毒刺数量的量化+每半球PAM神经元(c).n个 = 每组16个半球****第页 < 0.0001. ns，不显著。单因素方差分析（ANOVA），然后进行多组比较的Tukey检验。e（电子）用丝裂原荧光蛋白（mitoGFP）观察PAM神经元的线粒体网络。比例尺，5 微米。（f）顶部，显示绿色荧光蛋白圆形分布的直方图+测量的颗粒(e（电子）). 底部，高斯曲线适合圆形直方图。圆形范围从0（网状线粒体）到1（圆形线粒体）****第页 < 0.0001使用Kruskal–Wallis检验，然后使用Dunn检验进行多组比较。对每个基因型16个半球的500个线粒体颗粒进行分析。克14日龄苍蝇GFP标记PAM神经元TMRM荧光强度的定量。n个 = 每组18个半球。他，heterzogous。HO，纯合子。 **第页 < 0.01.帕姆 > EGFP公司与。PAM HO公园1 > EGFP公司,第页 = 0.0063.PAM HO公园1 > EGFP公司与。PAM HO公园1 > EGFP，Fer2,第页 = 0.0016. ns，不显著。单因素方差分析（ANOVA），然后进行多组比较的Tukey检验。中的框边界(b条), (d日)和(克)是第25和75个百分位，横穿方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。
图2
图2。第2学期过度表达保护PAM多巴胺能神经元免受氧化损伤。
一 w个1118，第2学期2/+,第2学期2,R58E02-GAL4型(PAM公司)和PAM > 第2学期苍蝇被喂以H2O（运行）2第7天24小时 第14天检测PAM神经元的数量。套圈2突变加剧，而第2学期过度表达可防止H2O（运行）2-诱导PAM神经元丢失。n个 = 每组16个半球。双尾Mann-Whitney检验**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001.w个1118控制（ctrl）vs.H2O（运行）2,第页 = 0.001之间。第2学期2/+ctrl与H2O（运行）2,第页 = 0.0076.PAM公司ctrl与H2O（运行）2,第页 = 0.0032. ns，不显著。b条ROS水平w个1118用H2DCF染料对不同年龄段的苍蝇进行监测。比例尺，25 微米。c来自(b条). 数据表示为相对于第1天的折叠变化。n个 = 每组14个半球。单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey’s多组比较测试**第页 < 0.01. 第1天与第35天，第页 = 0.0048.d日大脑Fer2:：GFP:：V5不同年龄的苍蝇用抗GFP（绿色）染色，用抗TH抗体（品红色）检测PAM神经元。比例尺，5 微米。e（电子）PAM区域的GFP和TH荧光强度(d日)被量化。数据表示为相对于第1天的折叠变化。n个 = 每组16个半球。单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey’s多组比较测试*第页 < 0.05, ****第页 < 0.0001. 第1天与第35天，第页 = 0.0117. 框边界在(一), (c)和(e（电子）)是第25和75个百分位，方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。
图3
图3。的标识第2学期通过结合ChIP-seq和RNA-seq方法实现转录目标。
一ChIP-seq在14日龄时进行Fer2:：GFP:：V5，Fer21苍蝇。w个1118苍蝇被用作阴性对照。n个 = 每组2次生物复制。b条通过Fisher对FER2 ChIP-seq峰的精确测试，发现含有E-box（CANNTG，下划线）的序列更加丰富w个1118ChIP系列。c热冲击驱动后识别DEG的全头RNA-seq分析方案第2学期短暂过度表达。n个 = 每组3个生物复制。显示了热冲击后上调和下调的DEG数量.d日ChIP-seq和RNA-seq数据示例（48 h） 两个人第2学期直接目标，CG8128号和skd公司矩形表示ChIP-seq峰值。
图4
图4。第2学期这些靶点有助于PAM神经元的维持和线粒体的健康。
一分离PAM神经元的RNA-seq分析方案。n个 = 每组3个生物复制。b条FER2 ChIP-seq鉴定的基因和48位全头RNA-seq鉴定的DEG基因之间的交叉 h、 PAM神经元RNA-seq中表达的基因。c26的网络可视化第2学期直接目标及其相互作用。每个节点代表一个基因，并根据其功能进行着色。线条粗细表示数据支持的强度。d日FER2峰的位置和影响第2学期过度表达第2学期直接目标级别。e（电子）48人的火山图 hRNA-seq数据。基因表达的变化通过t吨使用Cuffdiff2工具进行测试。橙色（下调）和蓝色（上调）圆点表示26第2学期直接目标。（f）通过抗TH免疫染色在35日龄苍蝇中检测到的每半球PAM神经元的定量，这些神经元在指示的第2学期PAM神经元的直接靶点。n个 = 每组14个半球。导致PAM神经元丢失具有统计学意义的基因型以红色突出显示。对这些基因型进行第二次独立复制以确认结果。单因素方差分析，然后进行Dunnett的多组比较测试**第页 < 0.01, ****第页 < 0.0001.Fer2-Gal4合金与。CG34357号运行经验，第页 = 0.0012.Fer2-Gal4合金与。ftz-f1型运行经验，第页 = 0.0031.Fer2-Gal4合金与。奥萨运行经验，第页 = 0.0070.Fer2-Gal4合金与。斯诺运行经验，第页 = 0.0015.克PAM RNA-seq中上调和下调的DEG中最富集的GO术语的网络可视化。GO术语根据其成员相似性分为簇。每个节点表示一个GO术语，并根据其集群ID进行着色。不显示集群的GO术语。GO术语详见补充数据5。小时通过抗TH免疫染色检测每半球PAM神经元的数量。n个 = 每组16个半球。单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey’s多组比较测试*第页 < 0.05, ****第页 < 0.0001.卡套2-Gal4、卡套22第1天与。卡套2-Gal4、卡套22第14天，第页 = 0.0152.Fer2-Gal4，Fer22第1天与。第2学期 > 草皮2，Fer22第1天，第页 = 0.0191. 中的框边界(（f）)和(小时)是第25和75个百分位，方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。
图5
图5。北约3在成年小鼠中脑DA神经元中表达。
一由多个蛋白质序列比对生成的系统发育树果蝇属FER2和鼠标TCF15、NATO3、PTF1A和TWIST1，使用ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).b条 硝酸钠如GTEx门户网站（gtexportal.org）所报告，通过RNA-seq测量人体组织中的表达水平。cRT-qPCR分析北约34个月时C57BL6小鼠不同脑区的mRNA表达水平。嗅球。PFC，前额叶皮层。vMB，腹侧中脑。dMB，中脑背侧。数据表示为散点图，水平线表示平均值。n个 = 每个地区3只动物。单因素方差分析，然后进行多组比较的Tukey检验。vMB与dMB以外的任何区域相比***第页 < 0.001（OB相对于vMB，第页 = 0.0002. OB与dMB，第页 = 0.0050. PFC与vMB，第页 = 0.0003. 纹状体vs.vMB，第页 = 0.0002. Cortex与vMB，第页 = 0.0002. 小脑vs.vMB，第页 = 0.0006). dMB与vMB和小脑以外的任何其他区域相比**第页 < 0.01（OB vs.dMB，第页 = 0.0066. PFC与dMB，第页 = 0.0071. 纹状体vs.dMB，第页 = 0.0054. 皮层vs.dMB，第页 = 0.0056). dMB与小脑#第页 = 0.0150.d日RT-qPCR分析北约3不同年龄C57BL6小鼠腹侧中脑mRNA表达水平。数据表示为散点图，水平线表示相对于表达式1个月的折叠变化平均值。n个 = 3（1个月），n个 = 5（4个月），n个 = 每组4只（14个月）动物。方差分析显示，不同年龄段之间无显著差异。e（电子）的代表性图像北约34月龄C57BL6小鼠腹侧中脑冠状切片的（品红色）原位杂交。箭头表示非特定信号。用抗TH抗体（绿色）检测mDA神经元。比例尺，50 微米。对来自2只独立动物的每只动物的3个冠状切片进行分析。（f）高倍图像北约3用抗TH抗体（绿色）检测SN和VTA mDA神经元的（品红色）原位杂交。对来自2只独立动物的每只动物的3个冠状切片进行分析。比例尺，10 微米。
图6
图6。北约3DA神经元中的cKO导致运动协调和活动的年龄依赖性损伤。
一有条件消融的策略北约3在分化的DA神经元中。b条RT-qPCR分析北约32月龄婴儿腹侧中脑mRNA水平北约3用鞭子抽打（ctrl）和北约3数据中心（cKO）小鼠。数据表示为相对于ctrl中平均表达水平的折叠变化。n个 = 5（ctrl）和n个 = 6只（cKO）小鼠。双尾Mann-Whitney检验*第页 = 0.0491.c的代表性图像北约34个月龄对照组和大鼠中脑腹侧冠状切片的（品红色）原位杂交北约3cKO小鼠。用抗TH抗体（绿色）检测mDA神经元。比例尺，10 微米。分析每个基因型2只小鼠的3个切片。d日TH百分比的量化+mDA神经元表达北约3来自(c). 300 TH以上+分析每个基因型的神经元。e（电子）电杆测试。显示了向下定向所需的时间（T-turn；left）以及转向和下降杆所需的总时间（T-tot；right）。受试动物数量为：n个 = 8（ctrl，7个月），n个 = 6（cKO，7个月），n个 = 11（ctrl，10个月），n个 = 9（cKO，10个月），n个 = 9（ctrl，10个月），n个 = 7（cKO，13个月）。双尾Mann-Whitney检验比较了同一年龄段的ctrl和cKO。13个月时的T型转弯*第页 = 0,0207. 13个月时的T-tot**第页 = 0.0032. ns不显著。（f）自愿车轮运转试验。显示了在方向盘上跑步的时间（左）和总距离（右）。n个 = 6只动物（ctrl，7个月），n个 = 6（cKO，7个月），n个 = 8（ctrl，10个月），n个 = 8（cKO，10个月），n个 = 11（ctrl，10个月），n个 = 9（cKO，13个月），n个 = 9（ctrl，16个月），n个 = 8（cKO，16个月）。双尾Mann-Whitney检验比较了同一年龄段的ctrl和cKO。16个月时的时间*第页 = 0.0206之间。16个月时的距离*第页 = 0.0360. ns不显著。中的框边界(一), (e（电子）)和(（f）)是第25和75个百分位，方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。
图7
图7。北约3DA神经元中的cKO不影响神经元完整性和纹状体DA水平。
一16至18个月龄对照组和北约3cKO小鼠。比例尺，200 微米。b条TH的量化+SN和VTA中的神经元(一). 数据表示为散点图，水平线表示相对于ctrl的折叠变化平均值。n个 = 每个基因型3只小鼠。通过双尾Mann-Whitney检验，ctrl和cKO之间没有统计上的显著差异。c16至18个月龄对照组和北约3cKO小鼠。比例尺，200 微米。d日背纹状体TH免疫染色的光密度测定(c). 数据表示为相对于ctrl中表达式级别的折叠变化。n个 = 10段（ctrl）和n个 = 每个基因型4只小鼠的9个切片（cKO）。通过双尾Mann-Whitney检验，ctrl和cKO之间没有统计上的显著差异。e（电子）对照组和对照组纹状体微透析灌流液中细胞外DA的基本水平（ng/μl）北约3cKO小鼠。n个 = 每个基因型4只小鼠。通过双尾Mann-Whitney检验，ctrl和cKO之间没有统计上的显著差异。框边界在(d日)、和(e（电子）)是第25和75个百分位，方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。
图8
图8。北约3对中脑DA神经元的线粒体完整性至关重要。
一TH中的线粒体通过抗COX4免疫染色（品红色）可见+11个月和16至18个月大的对照组和北约3cKO小鼠。比例尺，10 微米。b条COX4的圆度分布+TH中的线粒体颗粒+神经元来自(一). 双尾Kolmogorov-Smirnov检验****第页 < 0.0001. 700平方厘米+每组的颗粒来自每个基因型的3个大脑。c16至18个月龄对照组和对照组大鼠SN中TH标记DA神经元线粒体的电子显微照片北约3cKO小鼠。M、 正常线粒体。糖尿病，变性线粒体。n个 = 每组3只小鼠。比例尺，0.5 微米。d日TH线粒体完整性分类标准（左）和线粒体分布+6个月大和16至18个月大的对照组和北约3cKO小鼠（右）。来自TH的200至350个线粒体+对每组3只小鼠的SN神经元进行分析。比例尺，0.25 微米。e（电子）线粒体大小（顶部）和圆度（底部）的测量。SN TH的200至350个线粒体+对每组3只小鼠的神经元进行分析。小提琴绘图的水平线是中间线。单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey’s多组比较测试*第页 = 0.0280之间。ns，不显著。（f）11个月龄、16个月龄至18个月龄对照组和北约3cKO小鼠。用抗TH抗体（绿色）检测mDA神经元。比例尺，10 微米。克TH中SOD2荧光强度+神经元来自(（f）)被量化。小提琴图上的水平线是中间线。350（11个月时的ctrl和cKO+对每组3个大脑的神经元进行分析。双尾Mann-Whitney检验****第页 < 0.0001.小时,我RT-qPCR分析草皮2(小时)和神经保护转录因子(我)16至18个月龄对照组和对照组腹侧中脑mRNA相对水平北约3cKO小鼠。n个 = 每个基因型4只小鼠。方框边界是第25和75个百分位，方框的水平线是中间值，胡须表示最小值和最大值。双尾Mann-Whitney检验*第页 < 0.0286. ns不显著。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

工具书类

    1. Klein MO等人，《多巴胺：功能、信号传递和与神经疾病的关系》。单元格。摩尔神经生物学。2019;39:31–59.-公共医学
    1. Shulman JM、De Jager PL、Feany MB。帕金森氏病：遗传学和发病机制。每年。病理学版。机械。数字化信息系统。2011;6:193–222.-公共医学
    1. Connolly BS，Lang AE。帕金森病的药理学治疗：综述。JAMA公司。2014;311:1670.-公共医学
    1. Kalia LV，Lang AE.帕金森病。柳叶刀。2015;386:896–912.-公共医学
    1. Deng H，Wang P，Jankovic J.帕金森病的遗传学。《老龄化研究》2018年修订版；42:72–85.-公共医学

出版物类型