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.2022年7月；16(13):2470-2495.
doi:10.1002/1878-0261.13195。 Epub 2022年3月19日。

FET融合癌蛋白与肉瘤中BRD4和SWI/SNF染色质重塑复合物亚型的相互作用

马林·林登 1, 克里斯托弗·万纳斯 1, 托拜厄斯·斯特伦德 1 2, 丽莎·安德森 1, 艾曼·奥斯曼 1, 曼迪·埃斯科瓦尔 1, 亨利克·法格曼 1, 安德斯·圣赫伯格 1 2 三, 皮埃尔·奥曼 1
附属公司

FET融合癌蛋白与肉瘤中BRD4和SWI/SNF染色质重塑复合物亚型的相互作用

马林·林登等。 Mol Oncol公司. 2022年7月.

摘要

FET融合癌蛋白包含FET（FUS，EWSR1，TAF15）家族蛋白之一，与替代转录因子伙伴并列，是20多种肉瘤和白血病的特征。FET癌蛋白与SWI/SNF染色质重塑复合物结合，该复合物存在三种亚型：cBAF、PBAF和GBAF/ncBAF。我们使用综合生化分析来表征FET癌蛋白质、SWI/SNF-复合物和转录辅激活子BRD4之间的相互作用。在这里，我们报告了FET癌蛋白结合所有三种主要SWI/SNF亚型cBAF、PBAF和GBAF，并且FET癌蛋白质通过其共享的相互作用伙伴SWI/SNF-BRD4间接地与BRD4相互作用。此外，染色质免疫沉淀测序和蛋白质组学分析表明，FET癌蛋白、SWI/SNF组分和BRD4共同定位在染色质上，并与介质和RNA聚合酶II相互作用。我们的结果为FET-fusion诱导的致癌转录谱提供了可能的分子机制，并可能导致针对FET-fuse引起的恶性肿瘤中异常SWI/SNF复合物和/或BRD4的新疗法。

关键词：BAF；BRD4；EWSR1-FLI1；FUS-DDIT3；SWI/SNF；肉瘤。

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数字

图1
图1
SWI/SNF亚型及其与FET癌蛋白的相互作用。（A） 包含FET蛋白之一（FUS、EWSR1或TAF15）以及DNA结合转录因子伴侣的FET融合癌蛋白示意图。FET癌蛋白是许多不同亚型肉瘤和白血病的特征，列举了一些例子。其他FET‐FOP正在不断被发现。（B） 三种SWI/SNF亚型的示意图：cBAF（经典BAF）、PBAF（多溴BAF）和GBAF/ncBAF（GLTSCR1/L BAF，非经典BAF）。请注意，一些SWI/SNF组件由多个Paralog表示，例如相互排斥的BAF60A/B/C，一些子单元对于一个（或两个）SWI/SNF子类型是唯一的。报告的成分在研究之间略有不同，可能是由于所研究的细胞类型、提取和纯化方案以及分析方法。（C） 蛋白质印迹10 µg核提取物（在500中提取 米米KCl）使用针对核心成分（BAF155、BAF60A、BAF57和BAF47）、ATP酶模块成分（BRG1、BAF53A和SS18）、cBAF（ARID1A和BAF45D）的抗体，可视化粘液样脂肪肉瘤（MLS 402‐91、2645‐94和1765‐92）、尤因肉瘤（EWS TC‐71）和HT1080纤维肉瘤（wt、EGFP或FUS‐DDIT3‐EGFP）细胞中的SWI/SNF成分，PBAF（PBRM1、ARID2和BRD7）和GBAF（GLTSCR1、GLTSCR1L和BRD9）。带有所有螺栓的加载控件如图所示。 S1.（D）通过cDNA微阵列分析，对比HT1080，对五种黏液性脂肪肉瘤（两种高等级MLS圆细胞型，MLSRC和三种低等级MLS）中SWI/SNF成分的基因表达水平进行热图可视化。在某些情况下，使用两个或多个针对同一基因的探针，显示为单独的行。通过绿色（小于HT1080）和紫色（大于HT1080，使用直接IP方法可视化SWI/SNF复合体（BRG1、BAF155、BAF57和BAF47）和三个亚型的成功协同IP：cBAF（ARID1A）、PBAF（PBRM1和BRD7）和GBAF（GLTSCR1L和BRD9）。凝胶上装载了最大量的洗脱液和大约5%的输入物。所有样品都在同一凝胶上运行，并一起暴露。分离黑线表明，IgG样本来自凝胶的不同部分，未显示相邻通道。所有WB（全膜）的源数据可用作支持信息。
图2
图2
顺序盐提取分析强调了不同的染色质结合特征。（A） MLS 1765‐92、402‐91和2645‐94的Western blot（WB）分析，以及EWS TC‐71顺序盐提取（SSE）提取物可视化FET‐FOP FUS‐DDIT3（DDIT3抗体）或EWSR1‐FLI1(● FLI1抗体），以及EWSR1和FUS。（B） SSE结合图谱，可视化蛋白质的平均量(n个 = 3） 与EWSR1和FUS（调整后的P（P）值分别为0.0016和0.0018）。（C） MLS 1765‐92、402‐91和2645‐94以及EWS TC‐71 SSE提取物的Western blot分析显示SWI/SNF核心亚单位：BAF170、BAF155、BAF60A、BAF57、BAF47、BRG1、BRM、BAF53A和SS18。（D） SWI/SNF核心组件的SSE绑定配置文件(n个 = 4） 两个SWI/SNF核心蛋白的结合谱略有不同，如两个较小的图所示。（E） MLS 1765‐92、402‐91和2645‐94以及EWS TC‐71 SSE提取物的Western blot分析显示SWI/SNF亚型特异性亚单位：ARID1A和ARID1B（cBAF）、PBRM1、ARID2和BRD7（PBAF）以及GLTSCR1、GLTSCR1L和BRD9（GBAF）。（F） cBAF、PBAF和GBAF组件的SSE绑定配置文件(n个 = 4） 与BRD7相比，PBRM1的WB信号显示了一个独特的结合特征(P（P） = 0.0036). （G） MLS 1765‐92、402‐91和2645‐94以及EWS TC‐71 SSE提取物的Western blot分析显示PRC2成分EZH2和对照组蛋白H4。（A、C、E、G）加载WB：核SSE提取物（250 米米, 500 米米和1000 米米)对应于每个盐组分的相等初始体积，将其加载到凝胶上，以直接比较每个组分中提取的蛋白质量。（B，D，F）结合曲线：显示平均值+/-SD（标准差），n个 = 3-4。通过双向方差分析确定统计学显著性**P（P） < 0.01. 图中提供了每个细胞系的详细绘图。 S2。
图3
图3
SWI/SNF复合物和FET癌蛋白之间的稳健相互作用。（A） BRG1‐生物素免疫沉淀（IP）顺序盐提取物（250、500和1000）的定量western blot（QWB）分析 米米KCl）在MLS 402‐91和EWS TC‐71肉瘤细胞系中，可视化SWI/SNF成分（BRG1、ARID1A、BAF155和BAF57）、FET‐FOP FUS‐DDIT3和EWSR1‐FLI1（针对C末端伴侣的抗体）和正常FET蛋白（EWSR1和FUS）。每个细胞系的所有IP样品都在相同的凝胶上进行评估，每个抗体的条带都被同等对待，尽管为了更好地显示，显示了单独的矩形。较小的矩形表示样本的顺序不同，为了便于可视化而切割。（B） MLS 402‐91和1765‐92肉瘤细胞系BAF155‐生物素IP核提取物的定量western blot分析，可视化SWI/SNF成分（BAF155和BRG1）、FET‐FOP FUS‐DDIT3和正常FET蛋白EWSR1。MLS 1765‐92的另一个复制品如图所示。 S3B。（A‐B）加载IP‐QWB：输入（I）和洗脱液（结合，B）样品被稀释为相对非结合（NB），因此B+NB=100%，如图所示。 S3A系列。大约5%的输入被加载到凝胶上。
图4
图4
BRD4的表达、相互作用和抑制。（A） BRD4长亚型（BRD4-L）和短亚型（BR D4-S）的示意图可视化。指出了氨基酸数和潜在的SUMO翻译后修饰位点（PTM）。（B） 10例BRD4亚型的Western blot分析 µg核提取物（在500中提取 米米使用BRD4抗体（ab128874，N末端，两种亚型），对MLS 402‐91、2645‐94和1765‐92、EWS TC‐71和HT1080纤维肉瘤进行检测。图中显示了对另外两种BRD4抗体（C末端）的分析。 S4A。（C） MLS 1765‐92、402‐91和2645‐94以及EWS TC‐71 SSE提取物的Western blot分析显示了短和长BRD4亚型（BRD4抗体ab128874）。样品和加载与图中相同。 2.（D）BRG1‐生物素免疫沉淀（IP）顺序盐提取物的定量western blot分析（250、500和1000 米米KCl）在MLS 402‐91和EWS TC‐71中，可视化BRD4亚型co-IP（BRD4抗体ab128874）。样品和加载与图中相同。 3A。（E） 用FUS‐DDIT3‐EGFP、EWSR1‐FLI1‐EGFP或EGFP对照物（R1）瞬时转染HT1080纤维肉瘤细胞的BRG1‐生物素免疫沉淀核提取物进行Western blot分析，观察SWI/SNF复合物（BAF57）和BRD4的成功协同作用。R2‐R3如图所示。 S4E。（F） BRD4抑制（AZD5153，72小时）后，MLS细胞系2645-94、402-91和1765-92、EWS TC‐71、HT1080纤维肉瘤和成纤维细胞（F470）的细胞活力剂量反应曲线。显示平均值+/‐SD（标准偏差），n个 = 12个（2个生物，每个重复6个技术）。（G） MLS 402‐91对照细胞和BRD4抑制细胞（BRD4i，AZD5153，24）BRG1生物素免疫沉淀核提取物的Western blot分析 小时500 n个米)可视化SWI/SNF成分（BRG1、BAF57和BAF47）、FUS‐DDIT3、正常FET蛋白EWSR1和BRD4。（E，G）加载IP‐WB：在凝胶上加载最大量的洗脱液（B）和非结合（NB）。输入（I）样品相对NB进行稀释，并加载约5%的输入。
图5
图5
ChIP测序揭示了FUS‐DDIT3、SWI/SNF组件和BRD4的共同定位。（A） MLS 402‐91中BAF155、BRG1和FUS‐DDIT3的ChIP‐seq峰值曲线 ± 三 围绕TSS的kb（转录起始位点）。（B） 条形图显示了MLS 402‐91中BAF155、BRG1和FUS‐DDIT3 ChIP‐seq峰值的基因组分布。大多数峰位于靠近TSS的启动子、内含子或远端基因间位点。UTR：mRNA非翻译区。（C） 描述MLS 402‐91中BAF155、BRG1和FUS‐DDIT3 ChIP结合位点和注释基因重叠的维恩图。同一基因可能出现多次。顶部判定元件 新生代结合结合位点的荷马基序发现表明了该基序。（D） 使用由FUS‐DDIT3和至少一个SWI/SNF成分结合的4461个独特基因，从“反应组”基因集集合中显著丰富了基因集。显示了基于基因比率的前10名。基因计数由点大小和P（P）（调整后）颜色值。（E） 描述由异位FUS‐DDIT3‐EGFP表达显著调节的基因重叠的维恩图P（P）‐值≤0.05且对数倍变化≥ 1） 以及由FUS‐DDIT3和至少一个SWI/SNF成分结合的独特基因。通过Fisher精确试验确定显著富集(P（P） < 1e‐10）。（F） 维恩图描述了来自我们数据集的MLS 402‐91中BAF155、BRG1和FUS‐DDIT3 ChIP结合位点的重叠，以及来自Chen et al.数据集。
图6
图6
FET癌蛋白的相互作用体富含相分离倾向和转录组分。（A） 显著丰富了FUS‐DDIT3‐相互作用蛋白的Panther蛋白类。蛋白质类中蛋白质的百分比与与蛋白质类匹配的总蛋白质的百分比。（B） 从“反应组”和“基因本体论（GO）生物过程”基因集集合中显著富集FUS‐DDIT3相互作用蛋白的基因集。显示了基于基因比例的前10名。基因计数由点大小和颜色的q值表示。（C） FUS‐DDIT3和EWSR1‐FLI1相互作用蛋白质的饼图，相分离倾向得分（PScore）高于或低于4的截止值。（D） FET癌蛋白及其亲本蛋白相分离倾向评分（PScore）的可视化。饼图显示蛋白质高于或低于4的截止值。蓝点表示具有高相分离倾向的蛋白质，在截止点以上，用黑线显示。（E） SWI/SNF元件相分离倾向评分（PScore）的可视化。饼图显示蛋白质高于或低于4的截止值。红点表示在截止点以上具有高相分离倾向的蛋白质，用黑线显示。（F） 染色质附近潜在BRD4、介体、RNA聚合酶II和FET‐FOP结合SWI/SNF复合物相互作用的示意图可视化。（G） 对瞬时转染FUS‐DDIT3‐EGFP的HT1080细胞进行免疫荧光染色，用BRG1/BRD4、BRG1/MED1和FUS-DDIT3-EGFP/BRD4进行探测，并用激光扫描显微镜进行分析。显示了具有代表性的图像。比例尺：5 微米。（H） 在瞬时转染FUS‐DDIT3‐EGFP的HT1080细胞中，BRG1与BRD4、BRG1对MED1、FUS-DDIT3对BRD4，FUS-DDI T3对BRE1和FUS-DII T3对MED1共定位的皮尔逊相关系数。（I） 在用FUS‐DDIT3‐EGFP瞬时转染的HT1080细胞中，BRG1与BRD4、BRG1与MED1、FUS‐DDIT3与BRD4、FUS‐DDIT3与BRG1和FUS‐DDIT3与MED1共定位的Manders分裂系数。深灰色条对应蛋白质1（例如BRG1）与蛋白质2重叠的部分（例如BRD4），浅灰色条对应与蛋白质1重叠的蛋白质2（例如BRD）部分（例如BREG1）。
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