Interaction of Alpha Synuclein and Microtubule Organization Is Linked to Impaired Neuritic Integrity in Parkinson's Patient-Derived Neuronal Cells

doi:10.3390/ijms23031812

.2022年2月5日；23(3):1812.

doi:10.3390/ijms23031812。

α-突触核蛋白和微管组织的相互作用与帕金森病患者源性神经细胞神经炎完整性受损有关

附属公司

¹德国埃尔兰根-纽伦堡弗里德里希·亚历山大大学埃尔兰根大学医院分子神经病学系，91054。
²系统蛋白质组研究和生物分析，实验医学研究所，Christian-Albrechts-Universität zu Kiel，24105 Kiel，Germany。
^三德国埃朗根弗里德里希·阿莱克山德大学埃朗根大学医院干细胞生物学系，邮编：91054。
⁴埃朗根罕见疾病中心（ZSEER），埃朗根大学医院，德国埃朗根弗里德里希·阿莱克桑德大学（FAU），91054。

PMID： 35163733
预防性维修识别码： PMC8836605型
内政部： 10.3390/ijms23031812

α-突触核蛋白和微管组织的相互作用与帕金森病患者源性神经细胞神经炎完整性受损有关

卢卡斯·西鲍尔等。国际分子科学杂志. 2022.

.2022年2月5日；23(3):1812.

doi:10.3390/ijms23031812。

附属公司

¹德国埃朗根大学埃朗根医院分子神经病学系，埃朗根纽伦堡弗里德里希·阿莱克桑德大学，邮编：91054。
²系统蛋白质组研究和生物分析，实验医学研究所，Christian-Albrechts-Universität zu Kiel，24105 Kiel，Germany。
^三德国埃朗根弗里德里希·阿莱克山德大学埃朗根大学医院干细胞生物学系，邮编：91054。
⁴埃朗根罕见疾病中心（ZSEER），埃朗根大学医院，德国埃朗根弗里德里希·阿莱克桑德大学（FAU），91054。

PMID： 35163733
预防性维修识别码：第8836605页
内政部： 10.3390/ijms23031812

摘要

帕金森氏病（PD）的神经病理学特征是多巴胺能神经元的丢失和聚集的α-突触核蛋白（aSyn）的沉积。越来越多的证据表明，帕金森病中神经变性先于神经元丢失。一种可能的潜在机制可能是aSyn对神经症发育过程中微管组织的干扰，正如使用无细胞模型系统的几项研究所暗示的那样。在本研究中，我们研究了aSyn对aSyn过度表达的H4神经胶质瘤细胞和由携带aSyn基因重复的PD患者源性人诱导多能干细胞（hiPSCs）产生的中脑多巴胺能神经元细胞（mDANs）中微管组织的影响(SNCA公司^双面打印). 无偏质谱分析揭示了聚集的aSyn异构体与许多微管元素的优先结合。我们证实了aSyn与H4和hiPSC衍生的mDAN细胞模型系统中β-微管蛋白III的相互作用，并证明微管蛋白亚型从可溶部分到不可溶部分的显著再分配，伴随着不可溶aSyn水平的显著增加。一致地，SNCA公司^双面打印mDANs显示受损的神经突起表型，其特征是神经突起和突起生长受到干扰。总之，我们的发现提示了一种机制性途径，通过该途径，syn聚集干扰微管组织并诱导轴突损伤。

关键词：帕金森病；SNCA复制；α-同核蛋白；iPSC；微管；神经突起；神经变性。

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图1
aSyn过度表达H4细胞中aSyn和微管蛋白的相互作用。(A类)对aSyn过度表达H4细胞模型（高aSyn:H4-aSyn和H4-aSync tet-off细胞）及其各自的低aSyn表达细胞系（低aSyn:幼稚H4细胞和H4-aSyn tet-off+Dox）中的总aSyn及聚集aSyn进行斑点杂交分析。使用泛型aSyn抗体Syn 1测定总aSyn水平，而使用构象特异性抗体MJFR-14-6-4-2评估聚集的aSyn构象（聚合构象）水平。与各自的低aSyn对应物相比，两种aSyn过度表达的细胞株（高aSyn）表现出更高的aSyn聚集水平。通过直接蓝色染色控制总蛋白含量（如补充图S1所示）。为了量化，通过对总蛋白（直接蓝）和相应低aSyn细胞中的平均水平进行归一化，计算高aSyn电池中aSyn水平的折叠变化(n个=4）。统计：Mann-Whitney检验*第页< 0.05. (B类)使用泛aSyn抗体Syn1从H4-aSyn细胞中免疫沉淀aSyn。bTubIII和Tau共沉淀。对于免疫沉淀，使用不含洗涤剂的缓冲液（TBS，a）、含有非离子型温和洗涤剂（TBS+1%Triton X 100，b或TBS+1%NP40，c）的缓冲液或含有较强洗涤剂的缓冲器（RIPA，d）。bTubIII和Tau在所有条件下均可检测到。(C类)质谱鉴定H4-aSyn tet-off细胞中与aSyn共沉淀的蛋白质。使用pan-aSyn抗体Syn211或构象特异性抗-aSyn抗体MJFR-14-6-4-2进行共免疫沉淀。显示了质谱鉴定的共沉淀蛋白质的火山图（左：与Syn211共沉淀的蛋白质，右：与MJFR-14-6-4-2共沉淀的蛋白）。来自两个独立实验的重要蛋白质位于实线之上。已确定的微管相关蛋白通过其基因ID突出显示，并在表中列出。使用基于排列的FDR对Perseus（1.6.10.43）进行双尾t检验，以解释多重检验假设（随机分组期间保留了技术注射重复）。使用1%的FDR和2的折叠变化（s0）筛选候选。

图2
aSyn过度表达对微管组织的影响。(A类)用于分离可溶性（S）和不溶性微管相关组分（IS-MT）的细胞内分馏方法方案。(B类,C类,E类)WB图像(左边)和量化(**正确的**)aSyn的(B类)，bTubIII型(C类)以及从H4原始细胞和H4-aSyn细胞中提取的S和IS-MT组分中的乙酰化aTub（Acet.aTub，E）。为了量化，计算了IS-MT中aSyn、bTubIII或乙酰化aTub与S分数的比值，并使用了三个实验的值(n个= 3). aSyn在H4细胞中的过度表达导致aSyn和乙酰化aTub转移到IS-MT池中。统计学：非配对t检验*第页< 0.05. (D类,F类)总bTubIII的WB分析(D类)和乙酰化aTub水平(F类)在H4幼稚细胞和H4-aSyn细胞中。根据蓬索强度（如补充图S2所示）和H4原始细胞的平均水平，通过归一化计算折叠变化(n个= 4). 数值显示为平均值±SD。统计：Mann-Whitney检验*第页< 0.05.

图3
aSyn水平*SNCA公司^双面打印*患者来源的细胞。代表性WB图像(左边)和量化(**正确的**)分别从健康对照组（Ctrl）和复制患者（Dupl）中产生的NPC和mDAN中aSyn水平的差异达10天。aSyn水平显著高于*SNCA公司^双面打印*NPC和mDAN与对照细胞进行比较。相对水平是根据Ponceau强度和每个分化轮的对照系水平进行归一化计算的。数值显示为平均值±SD。两条控制线和两条控制线上的数值*SNCA公司^双面打印*行和每行三个独立的分化轮次用于定量(n个=3/线）。统计：Mann-Whitney检验*第页< 0.05, **第页< 0.01.

图4
细胞骨架蛋白的表达水平*SNCA公司^双面打印*患者衍生细胞。代表性WB图像和bTubIII的量化(A类,B类)，乙酰化aTub（acet.aTub）(C类,D类)和bActin(E类,F类)分化10天后NPC和mDAN的水平，由健康对照组（Ctrl）和*SNCA公司^双面打印*患者（双胎）。携带mDANs的bTubIII和乙酰化aTub水平显著降低*SNCA公司^双面打印*与健康人的对照mDAN相比，bActin水平在*SNCA公司^双面打印*mDAN。相对水平是根据Ponceau强度和每个分化轮的对照系水平进行归一化计算的。图中显示了用Ponceau染色控制bTubIII的蛋白质负荷。补充图S4A中提供了乙酰化aTub和bActin的Poceau染色。数值显示为平均值±SD。两条控制线和两条控制线上的数值*SNCA公司^双面打印*每个细胞系和三个独立的分化轮用于量化(n个=3/行）。统计：Mann-Whitney检验*第页< 0.05.

图5
aSyn和bTubIII的相互作用及其重组*SNCA公司^双面打印*mDAN。(A类)使用抗aSyn抗体（Syn1）对10天分化的hiPSC衍生mDANs的aSyn免疫沉淀进行WB分析。bTubIII与aSyn共沉淀。(B类)对照和*SNCA公司^双面打印*可溶性（S）和不溶性微管相关（IS-MT）馏分中aSyn和bTubIII的mDANs和WB分析。三个实验（#1、#2、#3）的代表性WB图像，其中mDAN来自一个对照和一个*SNCA公司^双面打印*hiPSC细胞系如图所示。请注意，由于免疫沉淀和细胞内分馏后的强烈稀释作用，将syn转移到如(A类,B类)只有通过将最大体积的药物加载到SDS-PAGE凝胶上并使用SuperSignal™West Femto maximum Sensitivity Substrate试剂盒（赛默飞世尔科技公司）才能看到。(C类)为了定量，计算了IS-MT中bTubIII或aSyn与S分数的比值。一条控制线和一条控制线上的值*SNCA公司^双面打印*每个细胞系使用三个独立的分化轮进行量化(n个=3/线）。aSyn在hiPSC-神经元中的过度表达导致aSyn和bTubIII转移到IS-MT池中。统计学：非配对t检验*第页< 0.05; **第页< 0.01.

图6
hiPSC分化神经元的轴突形态分析。(A类)神经元示例(左边)用于分析每个细胞的初级神经突起数(**正确的**). 使用ImageJ软件中的“Cell counter”插件计算bTubIII阳性神经元的Neurite数量。这个*SNCA公司^双面打印*与对照神经元相比，神经元每细胞显示更多的初级突起。总计n个>对每种情况下12幅图像中的800个神经元进行了检查。(B类)来自对照组和*SNCA公司^双面打印*hiPSC。通过使用ImageJ中的“直线”工具测量每个神经突起离开细胞体的位置的直径来检查神经突起的直径。定量显示直径<1µm的细神经炎在*SNCA公司^双面打印*神经元与对照神经元的比较。对每种情况下至少有800个神经突的显微镜图像进行检查。对于A和B中所示的量化，两条控制线以及两条控制线上的平均值*SNCA公司^双面打印*使用了行和每行三个独立的微分轮，以平均值±SD表示(n个=3/线）。统计：Mann-Whitney检验**第页< 0.01. (**C–F类**)控制和*SNCA公司^双面打印*神经元。(C类)对照组和对照组骨骼化神经元的代表性显微照片*SNCA公司^双面打印*神经元。细胞核以红色实心圆圈突出显示，类似于单细胞水平上Sholl分析的中心。(D类)带有神经突（白色）和重叠中心圆（绿色）的骨骼化神经元的Sholl分析方案。圆圈之间的半径间隔为3.3µm/步，距离神经元核（红色）中心的距离为10至250µm。(E类)神经突起交叉点的数量在*SNCA公司^双面打印*神经突起与对照神经元相比。为了量化，计算每个神经元的交集数。平均值±SEMn个=120控制和*SNCA公司^双面打印*分别显示了神经元。对于统计数据，每个细胞的交点减少由每个细胞交点的斜率减少决定，斜率减少范围为10–250µm（灰色），并使用非配对t检验评估控制和PD神经元（分别为120个神经元）之间的平均斜率差异(**第页< 0.01). (F类)左图：在躯体附近（距离范围为10至30µm，灰色）*SNCA公司^双面打印*神经元显著高于对照神经元，表明*SNCA公司^双面打印*神经元。统计学：双向方差分析*第页< 0.05, ****第页< 0.0001. 右图：在距躯体的长距离范围内（30至120µm，灰色）*SNCA公司^双面打印*神经元与对照神经元相比较低，表明*SNCA公司^双面打印*神经元。对于统计数据，每个细胞的交点减少量由每个细胞交点的斜率减少量确定，范围为30至120µm，并且通过非配对t检验评估控制神经元和PD神经元（120个神经元）之间的平均斜率差异(*第页< 0.05).

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