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.2022年3月28日；32（6）：1247-1261.e.6。
doi:10.1016/j.cub.2022.01.034。 Epub 2022年2月8日。

Naegleria的有丝分裂纺锤体由独特的微管蛋白构建而成，突出了核心纺锤体的特征

卡特里娜飓风B Velle 1, 安德鲁·肯纳德 1, 莫妮卡·特鲁皮尼奇 2, 阿里安·伊威克 三, 安德鲁·J·M·斯瓦福德 1, 艾米丽·诺尔顿 1, 卢克·M·赖斯 4, 伊娃·托利奇 2, 莉莲·弗里茨·莱林 5, 帕特里夏·沃兹沃思 6
附属公司

Naegleria的有丝分裂纺锤体由独特的微管蛋白构建而成，突出了核心纺锤体的特征

卡特里娜·贝勒等。 当前生物. .

摘要

格氏纳格勒菌（Naegleria gruberi）是一种单细胞真核生物，其与动物和真菌的进化距离使其有助于发展关于最后一个常见真核生物祖先的假说。内格列氏阿米巴缺乏细胞质微管细胞骨架，仅在有丝分裂期间组装微管，因此是研究有丝分裂微管蛋白及其组装纺锤体的进化和功能特异性的独特系统。以前的研究表明，阿米巴内格勒氏菌在有丝分裂期间表达一种发散的α-微管蛋白，我们现在发现阿米巴内格勒氏杆菌表达第二种有丝分裂α-和两种有丝裂β-微管素。有丝分裂微管蛋白与典型的α-和β-微管蛋白在进化上存在差异，并且含有表明不同微管特性的残基。这些不同的残基在“食脑阿米巴”福勒氏内格勒虫（Naegleria fowleri）的有丝分裂微管蛋白同源物中保守，使其成为潜在的药物靶点。利用定量光学显微镜，我们发现内格列氏菌的有丝分裂纺锤体是一个由微管束环构成的独特的桶状结构。与其他物种的纺锤体相似，奈格里亚的纺锤体是扭曲的，在有丝分裂过程中其长度增加，这表明有丝分裂的这些方面是祖先的特征。由于束数在中期发生变化，我们假设最初的束代表着动粒纤维，而次级束起着桥接纤维的作用。

关键词：内格列氏菌；细胞骨架；进化细胞生物学；微管；有丝分裂；原生生物；主轴；微管蛋白。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1。。奈格氏菌有鞭毛和有丝分裂微管阵列，由不同的微管蛋白组成
（A） 之间的进化关系内格勒菌属而其他真核生物则使用从Velle和Fritz-Laylin改良而来的枝序图（分支长度无意义）。（B） 将生长群体中的阿米巴（左）或分化群体中的鞭毛虫（右）固定，并用抗体（抗α-微管蛋白克隆DM1A，绿色）和微管蛋白跟踪器（荧光多西紫杉醇，青色）染色，以检测微管和Alexa Fluor 488结合的磷脂标记F-actin（洋红色）。显示了细胞的最大强度投影。（C） （A）中物种的γ-、α-和β-微管蛋白的进化关系用枝序图显示（使用A中的颜色方案；完整树见数据S2）。该树以γ微管蛋白为根，显示有丝分裂（绿色）和鞭毛（蓝色）微管蛋白内格勒菌属（闭合圆）和Acrasis公司（打开圆圈）。（D） 根据Fritz-Laylin和Cande报告的数据（来自包括6个技术重复的3个实验重复）计算阿米巴与鞭毛虫（顶部）或鞭毛虫与阿米巴（底部）相比微管蛋白mRNA的折叠变化。每个点代表一个实验复制，线表示平均±标准偏差（SD）。微管蛋白标有JGI识别号。另请参见图S1、数据S1、S2、S3、S4、S5和S6，以及表S2和S3。
图2。
图2.有丝分裂微管蛋白和鞭毛微管蛋白进化差异的比较分析
（A） 作为α-微管蛋白（顶部）和β-微管蛋白（底部）氨基酸位置函数的标准化分歧评分（STAR方法）图。较低的分数表明有丝分裂微管蛋白相对于鞭毛微管蛋白的差异性增加。对三种物种进行了分析：N.格鲁贝里（淡紫色钻石），N.福勒里（海军圈），以及A.科纳（蓝绿色方块）。水平灰色线表示我们用于识别特别是分歧点的两个标准偏差截止点。（B） 有丝分裂微管蛋白分化增加的位点的结构背景。侧链的位置N.格鲁贝里在微管晶格中的αβ-微管蛋白模型上，（A）中确定的氨基酸表示为棒状物（蓝色）（α-微管素，粉红色；β-微管素，石灰）。显示了晶格的“外部”和“内部”视图，并显示了纵向（标记为1）和横向（标记为2）微管晶格接触，以及α-微管蛋白的管腔（内部）表面（标记为3）。（C） 下表总结了微管-晶格界面附近散度升高的位置的比例。对于所有三种物种，α-微管蛋白与β-微管素相比有更多的差异位置，并且差异似乎在侧界面处特别丰富。另请参见图S2和S3、数据S5和S6以及表S2。
图3。
图3。。内格勒菌属的纺锤体是一个由微管束组成的桶形，随着有丝分裂的进行而伸长
（A） 异步增长内格勒菌属阿米巴固定后，用抗α-微管蛋白克隆DM1A（绿色）染色检测微管，用DAPI标记DNA（品红色）。有丝分裂纺锤体使用共焦显微镜成像（顶行），图像使用Autoquant软件解卷（底行）。细胞分为前期、中期或后期/末期。（B） 最大主轴长度（左）和长度一半的主轴宽度（右）的量化。每个点代表一个有丝分裂纺锤体，线条表示平均值（来自3个实验重复，包括以下细胞数：前期，n=6；中期，n=10；后期/末期，n=4）。如（A）所示，对主轴进行成像和去卷积。（C） 位于盖玻片平面上的中期纺锤的正交视图（如图a所示进行成像和反卷积）；斐济生成的XZ和YZ视图。（D） 垂直于盖玻片的纺锤的结构照明显微镜。（E） 有丝分裂细胞核的共焦显微镜和去卷积内格勒菌属细胞固定并染色以检测微管蛋白（YOL 1/34抗体，绿色，仅顶部面板）、DNA（DAPI，品红色）和核仁蛋白（DE6抗体，青色）。显示了一个最大强度投影（顶部单元格），而其余图像是单个z平面。（F） 微管束的透射电镜观察内格勒菌属; 箭头表示微管束，方框区域（左）显示为放大的插图（右）。另请参见图S3–S5和表S2。
图4。
图4微管束的数量随着有丝分裂的进行而变化
（A） 细胞固定并用抗体（抗α-微管蛋白克隆DM1A，绿色）染色以检测微管，DAPI标记DNA（品红色）。使用共焦显微镜对纺锤垂直于盖玻片的细胞进行成像，并使用Autoquant软件（顶部面板）进行去卷积，使用ChimeraX软件（底部面板，不按比例）进行三维重建。对于三个代表性细胞，显示了通过纺锤体大约25%、50%和75%的切片的单独z平面。数字（左上角）表示纺锤体所在位置不同微管束的数量。（B） 中期纺锤体中整个纺锤体长度的微管束数量，如（A）所示。一些纺锤体（顶部）在整个纺锤体中具有相当一致的微管束数量，而其他纺锤体（底部）在朝向中点的微管束数量上具有峰值。每行代表一个纺锤，从三个实验重复中汇集。（C） 中期细胞共聚焦图像中微管束的最大数量（根据包含21个细胞的4个实验重复计算）。每个点代表一个单元格。（D） 线扫描显示了盖玻片平面上纺锤体总强度投影的相对DNA和微管蛋白荧光强度，如（A）所示。中期纺锤体根据微管蛋白曲线的形状进行分组（左侧无肩部；中间为不清晰肩部；右侧为两个清晰肩部，用星号表示）；每个面板中显示了三个单独的示例（另请参见图S4G和S4H）。每条线代表一个主轴；从两个实验复制品的25个分析图像中，总共选择了15个具有代表性的纺锤波。（E） 如（D）所示，通过行扫描对DNA（顶部）或微管蛋白（底部）进行定量。中期根据肩部的存在（晚期）或不存在（早期）分为早期或晚期（无法明确分类的阶段除外）。每个点代表一个主轴线扫描曲线下的面积，线表示平均值±SD。数值是从52个主轴计算得出的，这些主轴来自4个实验重复。另请参见图S4和S6、视频S1和S2以及表S2。
图5。
图5。。奈格氏菌有丝分裂纺锤体扭曲
（A） 从侧面和端对视图显示3D重建的主轴（图4A右侧所示的相同主轴）。微管显示为绿色，DNA显示为紫色。从侧视图（左图）和端视图（右图）对微管束进行量化。每个束由不同的颜色表示，细线标记沿着束手动跟踪的点，粗线显示拟合圆的圆弧。（B） 从侧面（顶部）、末端（中部）和任意角度（底部）显示主轴的简化方案。微管束（绿线）由半径（r）的圆（虚线椭圆）拟合。表示主轴中心轴（实线）与拟合圆所在平面（虚线平行四边形）之间的角度（α）。表示管束与中心主轴的距离（d）。（C） 微管束的曲率是束长的函数（沿其极-极轴测量）。每个小点表示主轴内的单个束，而每个较大的点表示主轴的平均值。（D） 微管束的扭曲度是束长的函数。每个小点表示主轴内的单个束，而每个较大的点表示主轴的平均值。（C）和（D）中的数据来自4个实验重复，包括14个细胞和301个束。（E） 显示了右、弱右、弱左或弱左利手纺锤的百分比（有关此分析的详细信息，请参见图S6）。对来自4个实验重复的40个细胞的数据进行分析。另请参见图S6、视频S1以及表S1和S2。
图6。
图6有丝分裂模型内格勒菌属
（A） 在前期阶段内格勒菌属，微管束围绕着一个空心的DNA球体（品红）形成，该球体围绕着单个圆形的核仁（蓝色）。在早期中期，DNA浓缩，核仁开始分裂，微管束（浅绿色）组织成中空、扭曲的桶状。在中期晚期，DNA进一步浓缩，核仁分解成两个不同的球体。在靠近初级束的赤道区域（深绿色）形成一组次级微管。在后期/末期，DNA分离到纺锤体的两端，纺锤体伸长。详见正文。（B） 插图显示了后期A（左）和后期B（右）染色体分离的不同可能机制。
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