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.2022年1月7日；28(1):123-139.
doi:10.3748/wjg.v28.i1.123。

局灶黏附激酶相关非激酶通过抑制有氧糖酵解改善肝纤维化通过FAK/Ras/c-myc/ENO1途径

陶晃 1, 李元庆Xiao 1, 周明宇 1, 胡瑞涵 1, 邹高亮 1, 李建超 1, 舒峰 1, 刘永美 2, 长秦新 三, 赵学可 4
附属公司

局灶黏附激酶相关非激酶通过抑制有氧糖酵解改善肝纤维化通过FAK/Ras/c-myc/ENO1途径

陶晃等。 世界胃肠病杂志. .

摘要

背景：肝星状细胞（HSC）过度激活是肝纤维化发展的中心环节。HSC进行有氧糖酵解，为其活化提供能量。黏着斑激酶（FAK）促进癌细胞或成纤维细胞的有氧糖酵解，而FAK相关非激酶（FRNK）抑制FAK磷酸化和生物功能。

目标：从HSC有氧糖酵解代谢水平阐明FRNK对肝纤维化的影响。

方法：通过注射CCl建立小鼠肝纤维化模型4，并评估FRNK对模型中肝纤维化程度的影响。转化生长因子-β1用于激活LX-2细胞。检测397位酪氨酸磷酸化（pY397-FAK）以确定激活的FAK，并评估糖酵解相关蛋白单羧酸转运体1（MCT-1）和烯醇化酶1（ENO1）的表达。进行生物信息学分析以预测ENO1启动子区c-myc的假定结合位点，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双核糖核酸酶报告分析进行验证。

结果：人纤维化肝组织中pY397-FAK水平升高。FRNK基因敲除促进小鼠模型的肝纤维化。它还增加了原代肝星状细胞（pHSC）的活化、迁移、增殖和有氧糖酵解，但抑制了pHSC的凋亡。然而，在外源性FRNK处理LX-2细胞后，观察到这些现象的相反趋势。从机制上讲，FAK/Ras/c-myc/ENO1途径促进了有氧糖酵解，而外源性FRNK抑制了有氧糖解。

结论：FRNK通过抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1途径抑制HSC中的有氧糖酵解，从而改善肝纤维化。FRNK可能是肝纤维化治疗的潜在靶点。

关键词：有氧糖酵解；烯醇化酶1；粘着斑激酶；粘着斑激酶相关非激酶；肝星状细胞；肝纤维化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：作者没有要声明的利益冲突。

数字

图1
图1
FAK 397位的酪氨酸磷酸化上调，而FRNK在人纤维化肝组织中表达下调。A： 肝活检后进行H&E、Masson’s三色和Sirius Red染色，在200倍放大镜下评估正常人和肝纤维化患者的组织；B： 免疫组织化学显示，与肝纤维化患者相比，在200倍或400倍放大镜下，正常人肝脏中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达和FAK（pY397-FAK）397位酪氨酸磷酸化的变化；C和D：用Western blotting分析活检组织中的蛋白表达。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05之间。数据以平均值±SD表示。FAK：粘着斑激酶；FRNK：粘着斑激酶相关非激酶；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。
图2
图2
FRNK基因敲除后，小鼠肝纤维化加重。A和B:WT小鼠建模6周，pY397-FAK和FRNK蛋白表达水平体内每两周用Western blotting法测量一次；C和D：FRNK-/-和WT小鼠通过注射CCl建立肝纤维化模型4（1.5μL/g），4wk后用H&E、Masson’s三色和Sirius Red对这些小鼠的肝组织进行染色，并在光学显微镜×200倍放大镜下进行观察。对相对纤维化区域进行分析；E： 测定肝纤维化模型肝组织中羟脯氨酸的含量；F和G：Western blotting检测FRNK建立的肝纤维化模型中蛋白质的相对表达-/-小鼠和WT小鼠。显示了三个独立重复分析的代表性结果(n个= 6).一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01. 数据表示为平均值±标准偏差。MCT-1：单羧酸转运蛋白-1；ENO1：烯醇化酶1。
图3
图3
FRNK基因敲除促进肝纤维化和有氧糖酵解在体外.A： 用TGF-β1（2 ng/mL）培养36 h后，在光学显微镜下以200倍放大（105每个孔的细胞数）；B： 用CCK-8法评估pHSC的增殖；C： 干预36 h后用流式细胞仪分析pHSC的凋亡；检测在相同干预条件下培养的D和E:pHSC的葡萄糖摄取和消耗，并评估细胞培养液中的乳酸水平；F和G:MMC-1、ENO1和α-SMA在pHSC中的水平使用蛋白质印迹进行评估。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01结果表示为平均值±标准偏差。
图4
图4
外源性FRNK改善实验性肝纤维化和有氧糖酵解在体外.用同样编码FRNK基因的绿色荧光蛋白结合腺病毒载体（Ad-GFP）转染LX-2细胞。A： 用TGF-β1（2 ng/mL）培养36 h（105每个孔的细胞数）。通过在光学显微镜×200倍放大镜下分析细胞来测量迁移；B： 介绍了干预条件下培养的LX-2细胞的增殖情况；C： 流式细胞仪检测干预36 h后LX-2细胞的凋亡情况；检测在相同干预条件下培养的D和E:LX-2细胞的葡萄糖消耗和摄取能力，并评估细胞培养液中的乳酸水平；F和G：用Western blotting检测LX-2细胞中pY397-FAK、MCT-1、ENO1和α-SMA的水平。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01. 结果显示为平均值±SD。
图5
图5
FRNK不直接针对ENO1。A和B：从LX-2细胞中提取蛋白质，并测定pY397-FAK、K-Ras、c-myc和ENO1蛋白质的相对水平；C和D：用pcDNA-C-myc或pcDNA-vector（NC）转染LX-2细胞后，转染含有FRNK基因（Ad-FRNK）或阴性对照（Ad-GFP）的腺病毒载体，并用提取的蛋白通过Western blotting评估ENO1的表达；E： 人类ENO1启动子中假定c-myc结合位点的结构示意图，以及用抗c-myc或IgG进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析；F： 双荧光素酶报告基因测定显示用c-myc或NC质粒转染的LX-2细胞中WT、突变（MT）1和MT2-ENO1启动子的荧光素酶活性。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01. 结果显示为平均值±SD。
图6
图6
FRNK抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1通路改善肝纤维化的示意图。
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