Patient-derived organoids for personalized gallbladder cancer modelling and drug screening

doi:10.1002/ctm2.678

.2022年1月；12（1）：e678。

doi:10.1002/ctm2.678。

用于个性化胆囊癌建模和药物筛选的患者衍生有机物

博远¹, 赵晓芳², 王翔（音）^三, 刘二东⁴, 刘春良¹, 雅丽宗⁴, 右海江⁵, 侯明辉², 姚晨¹, 陈雷（Lei Chen）¹, 张永杰^三, 王洪阳¹, 景福¹

附属公司

¹信号转导国际合作实验室、肝癌信号调控与靶向治疗教育部重点实验室、上海市肝胆肿瘤生物学重点实验室、第二军医大学东方肝胆外科医院、中国上海。
²郑州大学第一附属医院有机物研究中心，河南郑州。
^三中国上海第二军医大学东方肝胆外科医院胆道外科二科。
⁴复旦大学生命科学学院，上海，中国。
⁵中国科技大学附属第一医院肿瘤研究中心生命科学与医学科，安徽合肥。

PMID： 35075805
预防性维修识别码： PMC8786696号
内政部： 10.1002/箱2.678

用于个性化胆囊癌建模和药物筛选的患者衍生有机物

博源等。临床翻译医学. 2022年1月.

.2022年1月；12（1）：e678。

doi:10.1002/ctm2.678。

作者

博远¹, 赵晓芳², 王翔（音）^三, 刘二东⁴, 刘春良¹, 雅丽宗⁴, 右海江⁵, 侯明辉², 姚晨¹, 陈雷（Lei Chen）¹, 张永杰^三, 王洪阳¹, 景福¹

附属公司

¹信号转导国际合作实验室、肝癌信号调控与靶向治疗教育部重点实验室、上海市肝胆肿瘤生物学重点实验室、第二军医大学东方肝胆外科医院、中国上海。
²郑州大学第一附属医院有机物研究中心，河南郑州。
^三中国上海第二军医大学东方肝胆外科医院胆道外科二科。
⁴复旦大学生命科学学院，上海，中国。
⁵中国科技大学附属第一医院肿瘤研究中心生命科学与医学科，安徽合肥。

PMID： 35075805
预防性维修识别码： PMC8786696号
内政部： 10.1002/箱2.678

摘要

背景：胆囊癌是一种相对罕见但侵袭性很强的癌症，临床发现较晚，预后较差。然而，缺乏与人类胆囊肿瘤特征一致的模型阻碍了致病机制和治疗的进展。

方法：我们建立了来源于人类胆囊癌以及正常胆囊和良性胆囊腺瘤（GBA）组织的类器官系。通过H&E染色、免疫组织化学和免疫荧光鉴定类器官培养的组织病理学特征。通过全基因组测序和RNA测序分析了类有机物的遗传和转录特征。筛选了一组靶向GBC中最活跃的信号通路的化合物，以确定其抑制GBC类器官的能力。在体外和体内评估候选化合物CUDC-101和CUDC-907的抗肿瘤作用。

结果：已建立的类器官稳定培养6个月以上，并在单细胞水平上密切再现原发组织的组织病理学、遗传和转录特征以及瘤内异质性。值得注意的是，对类器官的表达谱分析揭示了一组在三种亚型中不同的基因，因此可能参与胆囊疾病的恶性进展。更重要的是，我们发现双重PI3K/HDAC抑制剂CUDC-907显著抑制了各种GBC类有机物的生长，对正常胆囊类有机物毒性最小。

结论：患者来源的类器官可能是探索胆囊肿瘤分子发病机制和发现个性化药物的有用平台。

关键词：HDAC；药物筛选；胆囊癌；类有机物。

PubMed免责声明

数字

图1
人正常胆囊、良性胆囊腺瘤（GBA）和胆囊癌（GBC）组织中类器官的建立（A）实验设计。正常胆囊、良性GBA组织和GBC组织均取自接受手术的患者（患者信息详见表S1），并按照方法进行处理。（B）来自这些正常胆囊、良性GBA组织和GBC组织的器官样线的典型亮场显微镜图像。（C）器官线和原始组织的代表性H&E染色。（D）用免疫组织化学和免疫荧光法检测胆道标志物CK7在原发组织和相应器官中的表达。比例尺：200μm

图2
有机物保留了原始组织的遗传特征。（A）在初级组织（_T）和相应的类器官（_O）中识别的变异体之间的相关热图。（B）在所有样品中检测到的碱基取代的总体分布，包括类器官和相应的组织。（C）在每个类器官系和相应组织中检测到的外显子变异的比例。（D）概述在类器官系（O）和相应组织中检测到的突变。（E）通过计算体细胞突变，包括编码单核苷酸变体（SNV）和每兆碱基indels，评估胆囊腺瘤（GBA）和胆囊癌（GBC）患者的肿瘤突变负荷（TMB）。（F）具有代表性的匹配原发肿瘤标本和相应的类器官中的拷贝数改变（can）。显示了两个典型案例

图3
类器官系及其原始组织的转录组学分析（A）在培养基中扩增至少2个月后，原始组织（_T）和成对类器官系（_O）表达谱之间的相关热图（柱*z（z）*得分）。（B）《京都基因和基因组百科全书》（KEGG）对正常胆囊、胆囊腺瘤（GBA）和胆囊癌（GBC）类器官系中不同的基因集进行聚类分析。（C）原发组织和类器官系各亚型之间变化的热图分析（B与N，GBA与正常；M与B，GBC与GBA；M与N，GBC与正常）。（D）指示信号通路中代表性基因的热图分析

图4
类器官培养物及其原始组织的单细胞RNA测序。（A）统一流形近似和投影（UMAP）图显示了7124个单元的单元类型。（B）小提琴图显示标记基因在七种细胞类型中的平滑表达分布。（C） 7124个细胞的UMAP图显示了它们的起源。（D）每个样本中所示细胞类型簇的比例。（E） UMAP图显示上皮细胞，根据不同簇进行颜色编码。（F）显示样本来源的上皮细胞UMAP图。（G）每个样本中的子簇细胞类型的比例。（H）每个上皮细胞簇的前20个差异表达基因的热图。（一）所有上皮细胞的推测大范围拷贝数变化（CNV）的景观。左侧的注释轨迹指示推断的CNV簇和相应的采样原点。染色体编号标注在底部。红色表示拷贝数增加，蓝色表示拷贝数丢失

图5
胆囊癌（GBC）类有机物的体外药物筛选。（A）药物筛选设计。从29种靶向GBC中最活跃信号通路的化合物库中，我们鉴定了两种能够显著抑制GBC类器官的化合物。（B） 29种化合物对正常胆囊有机物生长的影响。（C） 20种化合物对GBC类有机物生长的影响，对正常胆囊类有机物无毒或低毒。（D）用伏立诺达和姜黄素治疗4天后，GBC类有机物活性的热图。（E）在10μM下用伏立诺达和姜黄素治疗4天后，正常和GBC类有机物的典型亮场显微镜图像。比例尺：200μm。（F）不同浓度伏立诺治疗4天后正常和GBC类有机物的细胞活力

图6
组蛋白去乙酰化酶（HDAC1）、‐2和‐6在胆囊癌（GBC）中的上调与不良预后相关。（A）免疫组织化学染色检测正常胆囊和胆囊癌组织中HDAC的表达。三个胆囊癌组织和一个正常胆囊中HDAC的代表性IHC染色。比例尺：100μm。（B）用ImageJ软件定量分析10例正常胆囊和100例胆囊癌标本中HDAC的表达。数据以平均值±SD表示(***P（P）* < 0.01). （C）显示GBC组织中HDAC1、HDAC2和HDAC6低水平和高水平表达的代表性显微照片。比例尺：100μm。（D–F）GBC标本中HDAC1（D）、HDAC2（E）和HDAC6（F）高表达和低表达组的生存曲线

图7
双组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和肿瘤促进途径抑制剂抑制胆囊癌（GBC）的类器官生长。（A）分别在5μM和10μM下用CUDC101和CUDC907处理4天后GBC类器官的代表性明场显微镜图像。比例尺：200μm。（B）用不同浓度的CUDC907处理4天后，正常和GBC类有机物的细胞活力。（C）通过western blot测定磷酸AKT、AKT和乙酰化组蛋白H3的表达水平，并以β-actin作为负荷对照。（D）将GBC类有机物接种到裸鼠皮下。异种移植瘤的典型图像。（E）测量肿瘤体积，结果表示为平均值±标准偏差（SD）**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01. （F）各组肿瘤组织中裂解Caspase 9、Ki67、磷酸化AKT和乙酰化组蛋白H3的免疫组织学（IHC）染色。比例尺：100μm

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