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.2021年10月；8（19）：e2100779。
doi:10.1002/advs.202100779。 Epub 2021年8月7日。

表观遗传失调诱导组蛋白H3转位到细胞质

王震（音） 1 2 三, 纪晨 1 2 三, 川高 1 三 4, 琼晓 1 2 三, 王喜伟 1 2 三, 山伯堂 1 2 三, 李庆兰 1 2 三, 薄忠 1 三 4, 知音歌 1 2 三, 洪白树 1 2 三 4, 李连云 1 2 三, 吴敏（音） 1 2 三
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表观遗传失调诱导组蛋白H3转位到细胞质

王震（音）等。 高级科学（Weinh）. 2021年10月.

摘要

在真核细胞中，染色质的核心成分，如组蛋白和DNA，封装在细胞核中。核物质泄漏到胞浆中会引起病理效应。然而，潜在的机制仍然难以捉摸。本文报道了由染色质失调（CLIC）诱导的哺乳动物细胞核材料的细胞质定位。小分子化学品HP1α敲除或H3K9甲基化酶SETDB1敲除对H3K9me3的抑制可诱导含有组蛋白H3.1、H4和细胞溶质DNA的细胞质斑点的形成，进而激活炎症基因和自噬降解。自噬缺陷可挽救H3降解，并增强炎症基因的激活。MRE11是MRN复合体的一个亚单位，在异染色质失调后进入细胞质。MRE11或NBS1的缺乏，而不是RAD50的缺乏，抑制了细胞液中的CLIC点。MRE11缺失可抑制HP1α缺乏引起的肿瘤生长，表明CLIC与肿瘤发生之间存在联系。这项研究揭示了异染色质失调诱导核物质移位到细胞质的新途径，这对炎症疾病和癌症很重要。

关键词：H3K9me3；HP1α；SETDB1；自噬；cGAS；异染色质。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
抑制H3K9me3可诱导组蛋白H3的细胞溶质定位。A） 在U2OS细胞中敲除SETDB1，用共聚焦显微镜分析组蛋白H3。比例尺，5µm。B） GFP‐LC3B‐U2OS细胞经5µ米用共焦显微镜研究BIX‐01294 8 h和H3。使用了三种不同的H3抗体。比例尺，5µm。C） 将HA‐SETDB1、Flag‐G9A和GFP‐SUV39H1转染到U2OS细胞中，并用5µ米BIX‐01294持续8 h。用共焦显微镜对指示的蛋白质进行成像。比例尺，10µm。D） 用抗DNA抗体对DNA进行染色，并用共焦显微镜进行研究。用Mito‐tracker标记线粒体（Invitrogen，M7521）。用5µ米BIX‐01294 8小时。E） GFP‐LC3‐U2OS细胞经5µ米BIX‐01294持续12 h。用共焦显微镜对组蛋白H4成像。比例尺，5µm。
图2
图2
异染色质的失调诱导组蛋白H3.1的细胞溶质定位。A） 用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜成像。比例尺，5µm。B） 用共焦显微镜对稳定表达野生型或K9M H3.1‐GFP的U2OS细胞进行成像。比例尺，20µm。细胞溶质H3点的平均数量如右图所示(n个（重量）=121，n个（K9M）=151）。使用t吨‐测试。***方法第页值<0.001。C）HP1α用siRNA在U2OS细胞中被敲除。H3和DNA用抗体染色并用共焦显微镜成像。比例尺，20µm。D） 如图所示，用免疫印迹法分析（C）中使用的细胞，H3和GAPDH作为负载对照。E） 用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜成像。比例尺，5µm。F） GFP‐LC3‐U2OS细胞经5µ米BIX‐01294 8小时，用H3.1或H3.3抗体染色，并用共焦显微镜成像。比例尺，5µm。
图3
图3
CLIC可能与H3K9me3对SINE转座子的下调有关。A） U2OS细胞用10µ米BIX‐01294 12小时。显示了组蛋白标记H3K9me3 ChIP‐Seq平均密度的转基因分析。该图以逆转录因子（RTE）区域为中心。B） 元基因分析表明，BIX‐01294处理后，所有SINE的归一化平均H3K9me3富集降低。C、 D）对照组和BIX‐01294处理细胞（C）或对照组和SETDB1 KO细胞（D）中RTE家族的H3K9me3相对富集。Y（Y）轴表示每个RTE系列的H3K9me3标签号与输入标签号的比率。E、 F）热图显示了转座子（SINE、LINE和LTR）在SETDB1 KO（E）或BIX‐01294处理（F）抑制的H3K9me3峰周围的分布。每行代表一个标度H3K9me3峰，其中包括±6 kb的侧翼区域。SINE标记为红色，LTR标记为黄色，LINE标记为蓝色，无逆转录酶区域标记为黑色。数据表明，SINE集中在SETDB1 KO（E）或BIX‐01294处理（F）抑制的H3K9me3区域的中部。G） 对照、BIX‐01294处理和SETDB1 KO细胞中一个代表性RTE区域H3K9me3富集的基因组浏览器视图。
图4
图4
细胞溶胶H3通过自噬降解。A） 用5µ米BIX‐01294，8小时，不含20µ米以免疫印迹法、GAPDH和H3作为负荷对照，分析24 h CQ的LC3水平。B） 用5µ米BIX‐01294持续6小时，并用TEM成像。比例尺，如图所示。C） 用所示抗体、GAPDH和H3作为对照，通过免疫印迹法分析WT和SETDB1‐KO U2OS细胞。*代表非特定波段。D） GFP‐LC3B‐U2OS细胞转染NC和HP1αsiRNA，并用共聚焦显微镜成像。比例尺，20µm。E） 用指示浓度的BIX‐01294处理稳定表达H3.1‐GFP的U2OS细胞8小时，有或没有100 n米Baf A1 24 h，然后进行免疫印迹分析。F） 用5µ米BIX‐01294持续12小时，内源性LC3被免疫沉淀。按指示进行蛋白质印迹。HC，重链。LC，轻链。G） 重量，自动液位计5KD和自动液位计7用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜成像。比例尺，20µm。的级别自动液位计5和自动液位计7以免疫印迹法、GAPDH作为负荷对照进行分析。
图5
图5
CLIC激活cGAS信号通路。A） 用10µ米BIX‐01294持续12小时，并按指示进行免疫印迹分析，以GAPDH和H3为对照。B） 用siRNAs敲除L929细胞中的Sting。然后用10µ米BIX‐01294持续8小时，并通过免疫印迹、H3和GAPDH作为负荷控制进行分析。C） 用10µ米BIX‐01294持续12 h，并用定量RT-PCR分析所示基因。D） 用10µ米BIX‐01294持续12 h，并用定量RT-PCR分析所示基因。E）自动液位计5在U2OS中被CRISPR击倒。然后用10µ米BIX‐01294持续8 h，并通过免疫印迹分析，GAPDH和H3作为负荷控制。F） WT和自动液位计7用10µ米BIX‐01294持续12 h，并用定量RT-PCR分析所示基因。使用t吨‐测试。**方法第页值<0.01，*方法第页数值<0.05。
图6
图6
CLIC需要MRE11和NBS1。A） 用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜成像，如图所示。箭头表示细胞溶质MRE11点。比例尺，10µm。B）MRE11型用siRNA在U2OS细胞中被敲除。用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜进行分析。比例尺，5µm。用免疫印迹法分析MRE11水平，以H3为负荷对照。C）HP1α在U2OS中或与一起被击倒MRE11型然后用共焦显微镜对细胞成像。比例尺，5µm。用免疫印迹法测定MRE11和HP1α水平，以GAPDH作为负荷对照。D）国家统计局1在U2OS细胞中被击倒。用5µ米BIX‐01294持续8小时，并用共焦显微镜进行分析。比例尺，5µm。采用免疫印迹法测定NBS1水平，以GAPDH为负荷对照。E） 用5µ米BIX‐01294适用于8小时且不含100µ米MRE11抑制剂9小时（PFM01用于核酸内切酶活性，PFM39用于核酸外切酶活性），并用共焦显微镜成像。比例尺，10µm。F）MRE11型在U2OS中被击倒。用10µ米BIX持续12 h，并用定量RT-PCR分析所示基因。使用t吨‐测试。**方法第页值<0.01。第11页通过免疫印迹法、H3和GAPDH作为负荷对照测定水平。
图7
图7
CLIC与结直肠癌相关。A） 小鼠腹腔注射20 mg kg−1BIX‐01294持续24小时。显示了治疗小鼠和对照小鼠肾脏的代表性H3免疫荧光图像。箭头表示细胞溶质CLIC点。比例尺，20µm。B） 患者结直肠癌组织芯片用H3抗体进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。共分析了8例正常组织和40例癌组织。在10%（4/40）的癌组织中发现了细胞质H3，但在正常组织中未发现。C–E）异种移植实验HP1α和MRE11型敲除HCT116结肠癌细胞。8 × 105裸鼠皮下注射细胞，18天后收获肿瘤。肿瘤的图片（C），其重量（D）和体积（E）显示为平均值±SEM，n个（sgCtrl）=9，n个（sgMRE11型) = 8,n个（sgHP1α)=8，以及n个（sgHP1α+新加坡MRE11型) = 9. 使用t吨‐测试。**方法第页值<0.01，***对于第页值<0.001。F） 与CLIC相关的流程示意图。
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