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.2021年8月11日；29（8）:1316-1332.e12。
doi:10.1016/j.chom.2021.06.004。 Epub 2021年7月7日。

感染期间沙门氏菌肠道宿主蛋白相互作用的全球定位

菲利普·沃尔奇 1, 乔尔·塞尔克里格 2, Leigh A打结器 三, 曼迪·雷特尔 4, 弗兰克·斯坦因 4, 基思·费尔南德斯 2, 克里斯蒂娜·维特斯 5, Clément M Potel公司 2, 卡罗琳·舒尔岑 2, 马提亚斯·盖尔 6, 克莱门斯·罗特纳 7, 奥利维亚·斯蒂尔-莫蒂默 8, 米哈伊尔·萨维茨基 9, 大卫·W·霍尔顿 10, Athanasios Typas公司 11
附属公司

感染期间沙门氏菌肠道宿主蛋白相互作用的全球定位

菲利普·沃尔奇等。 宿主与微生物. .

摘要

细胞内细菌病原体注射效应蛋白来劫持宿主细胞过程并促进其生存和增殖。为了系统地绘制感染期间的效应-宿主蛋白-蛋白相互作用（PPIs），我们生成了32株鼠伤寒沙门氏菌血清型（STm）菌株的文库，这些菌株表达染色体编码的亲和标记效应子，并定量巨噬细胞和上皮细胞中的PPIs。我们鉴定了446个效应宿主PPI，其中25个之前已经描述过，13个通过相互免疫共沉淀进行了验证。虽然效应器聚合在同一宿主细胞过程中，但大多数具有多个靶点，这些靶点在细胞类型之间往往不同。我们证明，SseJ、SseL和SifA部分通过胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1蛋白调节沙门氏菌空泡（SCV）的胆固醇积累。PipB将细胞器接触位点蛋白PDZD8招募到SCV，而SteC通过磷酸化formin样蛋白促进肌动蛋白结合。本研究提供了一种在感染过程中探测宿主-抗原PPI的方法和一种研究STm效应器机制的资源。

关键词：FMNL；NPC1；PDZD8；肌动蛋白捆绑；细菌病原；胆固醇贩运；效应器；蛋白质相互作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.AP-QMS管道用于在沙门氏菌感染
（A）S公司携带带有STF（FLAG（2x）-TEV-STREP（3x））的C-末端标记效应物的Tm菌株在MOI~100感染HeLa和RAW264.7细胞。样品要么用DSP交联剂处理，要么直接裂解为天然抗FLAG下拉物。在TMT-10plex标记运行中合并来自下拉的洗脱液，并通过LC-MS/MS测量。合并来自九种不同STF标记的效应物和一种未标记的野生型背景对照的洗脱液。（B） 只有用至少两种独特肽量化并在至少两个生物复制品中鉴定的蛋白质才用于分析。当错误发现率（fdr）小于1%并且显示出至少20%的倍增长时，蛋白质是“命中”的。如果PPI在自然条件和交联条件下都通过了折叠变化（FC）要求，我们将fdr要求放宽到<5%，从而进一步完善了该列表。随后，每个效应器在FC或fdr方面只有最强的20个PPI，以及在本机下拉菜单和交联下拉菜单中检测到的PPI，被保留在最终的命中列表中。表S2列出了所有分析数据和点击数。所有下拉的火山图都可以在门德利数据中找到。PPI网络是通过点击和已知的主机功能交互构建的。
图2。
图2。。S公司RAW264.7巨噬细胞中的Tm效应靶物理相互作用
（A） 12个国家之间确定的PPI网络S公司20 hpi时RAW264.7细胞中的Tm效应器及其靶蛋白。这里只显示了AP-QMS中被鉴定为诱饵的效应器和通过图1B所述标准的靶蛋白。RAW264.7细胞的宿主蛋白显示为金色或黑色（先前确定的相互作用；表S3）。S公司Tm为灰色。边缘颜色表示捕捉到的条件相互作用，厚度与褶皱变化成比例（Log2). 与功能相关的集群会相应地进行分组和注释。使用Cytoscape 3.7.2版生成网络（Shannon等人，2003）。从内置的STRING DB版本11（Szklarczyk等人，2019）蛋白质查询中提取小鼠尿液以及细菌与细菌的功能相互作用小家鼠和沙门氏菌置信下限为0.7。（B） 20 hpi时RAW264.7细胞中已识别PPI的概述。点击按鼠还是鼠进行分组S公司Tm来源（上部直方图），或根据是否在天然或交联下拉样品中检测到（下部维恩图）。（C） 对所有已确定的PPI合作伙伴之间的丰富流程进行GO定期分析。根据富集显著性（负对数，经多次测试校正）（Benjamini和Hochberg，1995；Bindea等人，2009）对GO-项簇进行排序，并显示前10个GO-簇。n表示簇中存在的蛋白质数量。富集标准化为AP-QMS实验中的组合背景蛋白质组。完整的浓缩物列表见表S4。
图3。
图3。。S公司HeLa上皮细胞中的Tm效应物-宿主-靶点物理相互作用
（A） 在20 hpi的HeLa细胞中，9个STm效应器及其靶蛋白之间鉴定出PPI网络。网络的生成和描述如图2A所示，但HeLa互动器为蓝色，来自STRING的人类数据用作输入以生成边。（B） 如图2B所示，20 hpi时HeLa细胞中已识别PPI的概述。（C） 如图2C所示，对整个网络的生物过程进行长期分析。
图4。
图4.比较S公司Tm在RAW264.7和HeLa细胞中相互作用，以及相互的PPI验证
（A） 两种细胞系和条件下PPI的文氏图比较。（B） 使用针对宿主靶点的抗体进行相互下拉，以验证20 hpi时AP-QMS筛查中检测到的PPI。具有类似表达水平的效应器作为阴性对照用于平行下拉。通过感染PDZD8-myc转染的HeLa细胞进行PipB-PDZD8双向下拉S公司Tm公司SL1344型Δ皮普B辅以PipB-2HA在trans中; Δ管道B2表达PipB2–2HA在trans中用作阴性对照。除LASP1和GroEL下拉外，进行了两个独立的复制实验，这两个实验进行了一次。每个交互显示一个示例性斑点，所有斑点和原始图像都位于附带的门德利数据中。Western Blot图像周围的彩色框对应于测试的细胞背景和条件（参见面板A图例）。经验证的相互作用用箭头表示，星号表示抗体重链（HC）。（C） 原木的小提琴图2AP-QMS中所有效应靶蛋白的富集倍数，这些效应靶蛋白选择通过反向下拉（白色）测试，那些可以（绿色）或不能（红色）验证，以及那些在反向下拉中未检测到诱饵的蛋白（灰色）。虚线表示中间值（粗体）和四分位范围（浅色）。显著性检验采用双尾Mann-Whitney检验。图中显示了HeLa细胞（蓝色）和RAW264.7（橙色）中确定的相互作用的富集情况，以供比较。（D） 验证摘要。在上表中，相互作用被视为与条件或细胞系无关。在这种情况下，对AP-QMS工作中检测到的13个PPI以及总共19个相互作用的6个非同源对照进行了评估。在下表中，每个细胞系和条件被视为一个单独的实验，其中评估了来自AP/MS工作的22个PPI和14个非同源对照（即总共36个相互作用）。表S5列出了所有评估的个体交互作用。
图5。
图5 NPC1被SifA招募到SCV中，在那里它与SseJ发生物理作用，并在功能上被SseL对抗
（A） 与未标记的相比，在20 hpi条件下交联下拉STF-标记的SseJ后HeLa细胞中的富集S公司Tm控制（图S5A中的本地下拉）。在一次TMT运行中测量了SseJ-STF和野生型的三个重复。深蓝色：FC>1.5，p值<0.001；浅蓝色：FC>1.2，p值<0.01。所有点击都可以在随附的门德利数据中找到。（B） 感染野生型HeLa细胞的共焦显微镜图像（60倍），Δ日本证券交易所, Δ日本证券交易所Δ资产负债表和Δ信号A S在12 hpi（MOI=100）表达mCherry（pFCcGi）的Tm。细胞用Hoechst 33342、抗LAMP1和抗NPC1染色。合并显示S公司Tm为红色，NPC1为绿色。对于ΔsifA信号显示了两个示例–一个宿主细胞，其中S公司Tm在SCV（上部）和SCV破裂处生长S公司Tm位于胞浆中（下部）。使用相同处理的NPC1-K.O.细胞来评估抗NPC1的特异性（蓝色边界）。图S5C显示了SCV NPC1定位的量化。比例尺：SCV处胆固醇的10μm（C）积累（用filipin染色）。分析了三个独立实验中总共416个手动检查的视野（FOV），每个实验中有四个技术复制品（代表性图像见图S5D）。细胞内共定位区域的平均filipin强度S公司LAMP1染色的Tm（排除细胞溶质细菌）除以细胞膜内测得的平均filipin强度。根据FOV（箱线图中显示的n）进行分析。FOV平均含有20个感染细胞。箱线图（中值和IQR，误差条根据Tukey），胡须跨越Q10到Q90。使用带Welch校正的未配对双侧T检验计算p值，无需对多次测试进行校正。
图6。
图6 PipB在感染期间与SCV结合并招募PDZD8
（A） 带有PipB截断版本的Y2H。如在His条件下生长所示，与PDZD8的直接相互作用被PipB的20个氨基酸C末端的缺失所消除。（B） 带有PDZD8截短版本的Y2H。PDZD8的C-末端225氨基酸缺失会损害其与PipB的相互作用。（C） 对转染EGFP、EGFP-PipB、EGFP-PipB（Δ270-291）或EGFP-PipB2融合物的HeLa细胞免疫沉淀物进行Western Blot分析。使用抗PDZD8肽抗体和抗GFP抗体，通过免疫印迹法分析内源性PDZD9的抗-GFP免疫沉淀物。PipB-PDZD8相互作用需要PipB的最后22个氨基酸。使用PipB2作为阴性对照。（D） 用EGFP-PipB或EGFP-PipB（Δ270-291）转染HeLa细胞，并对内源性PDZD8（红色）进行免疫染色。用Hoechst 33342（蓝色）检测DNA。比例尺：用表达myc标记PDZD8的质粒转染HeLa细胞并感染S公司Tm公司SL1344型Δ皮普B补充的在trans中与PipB-2HA（和组成性表达m樱桃色来自染色体）。上排：通过使用抗HA抗体进行免疫染色和使用抗myc抗体进行PDZD8染色，可以观察到转移的PipB。感染细胞显示PDZD8-myc明显重新分布到SCV。下一行：上一行为HeLa细胞，LAMP-1免疫染色。典型图像显示PDZD8-myc重新分布到SCV（用LAMP-1修饰），而PDZD8-myc仍然局限于未感染细胞的内质网。比例尺：10μm。（F） 荧光显微镜图像显示，易位的2xHA标记的PipB与PDZD8共定位。用表达PDZD8-myc的质粒转染HeLa细胞并感染S公司Tm公司SL1344型Δ管道B补充的在trans中使用PipB-2HA，并在12 hpi下进行免疫染色。叠加显示PipB-2HA为绿色，PDZD8-myc为红色，LAMP-2（装饰SCV和SIF）为蓝色。PDZD8主要定位于SCV而非SIF。（G） 感染细胞中PDZD8募集的量化。用表达PDZD8-myc的质粒转染HeLa细胞并感染S公司Tm公司SL1344型野生型，Δ皮普B, Δ皮普B用PipB-2HA或PipB-2A（Δ270–291）补充12 hpi。所有菌株组成性表达m樱桃色来自染色体。PDZD8定位是指感染细胞向SCV募集PDZD8-myc的分数。来自三个独立实验的数据，每个实验大约有100个细胞，n表示细胞总数。误差线表示标准偏差。PDZD8-myc定位于SCV依赖于全长PipB表达在trans中.
图7。
图7：SteC直接靶向FMNL蛋白以促进肌动蛋白细胞骨架重排
（A） 纯化重组FMNL1的尺寸排除色谱图1–385、SteC（上面板）或催化无效的SteCK256H（公里）（下面板）。FMNL1预注入1–385带SteC或SteCK256H（公里）如虚线所示，与单个纯化蛋白质相比，导致洗脱体积向左移动。（B） 术后放射自显影在体外激酶分析。FMNL1（FMNL1）1–385纯化并与纯化的SteC激酶以及SteC一起孵育K256H（公里）在有放射性标记的情况下[32P] -γ-ATP。考马斯蓝染色显示蛋白质输入。只有催化活性的SteC才能进行自磷酸化和磷酸化FMNL1。（C） FMNL1和FMNL2的蛋白质图谱，包括功能区、二级结构元素和在在体外激酶分析，然后是磷酸蛋白质组学。颜色：蓝色：在第一个复制中识别（使用50μM ATP），红色：在第二个复制中标识（5mM ATP）黑色：在两个复制中都识别。SteC的磷酸化主要发生在FMNL1和FMNL2的柔性环中。结果见表S6。（D） mCherry-expressing感染3T3成纤维细胞（8 hpi）后的典型荧光显微镜图像S公司Tm菌株（MOI 100），用DAPI（蓝色）和指骨蛋白（紫色）染色。来自FMNL2/3敲除细胞的三个独立实验（Kage等人，2017b）和野生型3T3成纤维细胞的两个独立实验的数据，跨越162个FOV（平均每个视图20个感染细胞）。箭头表示细胞内S公司Tm微克隆。比例尺：30μm。定量显示在E中。（E）S公司Tm微克隆除以总平均肌动蛋白信号强度作为肌动蛋白的测量值-S公司Tm共同本地化。对60口井的162个FOV进行了分析，并显示为箱线图。箱线图和统计测试，如图5C所示。（F） SteC-FMNL相互作用模型：（i）SteC直接结合FMNL亚家族formins，对其磷酸化是必要和充分的。（ii）磷酸化FMNL formins和Cdc42之间的相互作用诱导肌动蛋白聚合（Kühn et al.，2015）。
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