Screening and identification of Theileria annulata subtelomere-encoded variable secreted protein-950454 (SVSP454) interacting proteins from bovine B cells

doi:10.1186/s13071-021-04820-4

.2021年6月11日；14(1):319.

doi:10.1186/s13071-021-04820-4。

牛B细胞环状泰勒虫亚群编码可变分泌蛋白-950454（SVSP454）相互作用蛋白的筛选与鉴定

直隶¹, 刘俊龙², 马全英¹, 刘爱红¹, 李有权¹, 桂泉关¹, 罗建勋¹, 洪寅^三 4

附属公司

¹兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。
²兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。liujunlong@caas.cn。
^三兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。yinhong@caas.cn。
⁴江苏省重要动物传染病和人畜共创预防控制中心，扬州，225009，中华人民共和国。yinhong@caas.cn。

PMID： 34116718
预防性维修识别码： PMC8196448号
内政部： 10.1186/s13071-021-04820-4号

牛B细胞环状泰勒虫亚群编码可变分泌蛋白-950454（SVSP454）相互作用蛋白的筛选与鉴定

直隶等。 Parasit矢量. 2021.

.2021年6月11日；14(1):319.

doi:10.1186/s13071-021-04820-4。

作者

直隶¹, 刘俊龙², 马全英¹, 刘爱红¹, 李有权¹, 桂泉关¹, 罗建勋¹, 洪寅^三 4

附属公司

¹兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。
²兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。liujunlong@caas.cn。
^三兽医病原生物学国家重点实验室、甘肃省兽医寄生虫学重点实验室、中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046。yinhong@caas.cn。
⁴江苏省重要动物传染病和人畜共创预防控制中心，扬州，225009，中华人民共和国。yinhong@caas.cn。

PMID： 34116718
预防性维修识别码： PMC8196448号
内政部： 10.1186/s13071-021-04820-4号

摘要

背景：环形泰勒虫是一种原生动物寄生虫，可以感染和转化牛B细胞、巨噬细胞和树突状细胞。转化的机制尚不清楚，一些寄生虫分子已被鉴定，它们通过调节宿主信号通路促进细胞增殖。泰勒虫亚染色体可变分泌蛋白（SVSP）可能影响宿主细胞表型，但其功能尚不明确。因此，在本研究中，我们探索了SVSP454与宿主细胞蛋白的相互作用，以研究环孢霉与宿主细胞相互作用的分子机制。

方法：利用qRT-PCR技术分析了环纹夜蛾SVSP454中SVSP蛋白在不同生命阶段和转化细胞传代之间的转录水平。然后，以SVSP454为诱饵，利用酵母双杂交（Y2H）系统从牛B细胞cDNA文库中筛选其相互作用蛋白。通过共免疫沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）分析，进一步鉴定了宿主细胞与SVSP454的潜在相互作用蛋白。

结果：SVSP454在环状木霉的所有三个生命阶段都有转录，但在裂殖体阶段转录率最高。然而，随着培养物的传代，SVSP454的转录水平不断下降。筛选出两种蛋白质，Bos Taurus coiled-coil domain 181（CCDC181）和Bos Tarus线粒体核糖体蛋白L30（MRPL30）。进一步鉴定了宿主的蛋白质CCDC181和MRPL30与SVSP454直接相互作用。

结论：本研究以SVSP454为诱饵质粒，利用Y2H系统筛选出其捕食蛋白CCDC181和MRPL30。然后，我们通过Co-IP和BiFC分析证明SVSP454与CCDC181和MRPL30直接相互作用。因此，我们推测SVSP454-CCDC181/SVSP454MRPL30是一个相互作用的轴，通过一些重要的信号分子调节宿主的微管网络和翻译过程。鉴定SVSP454与CCDC181和MRPL30的相互作用将有助于阐明环孢霉诱导的转化机制。

关键词：BiFC公司；CCDC181；Co-IP；MRPL30；SVSP454；环状泰勒虫；酵母双杂交。

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提交人声明，他们没有相互竞争的利益冲突。

数字

图1
SVSP950454在mRNA水平上的转录谱。一SVSP454在不同阶段的mRNA水平*环状木霉*.b条SVSP454在不同细胞培养通路中的mRNA水平*环状木霉-*受感染细胞

图2
使用CELLO v.2.5的SVSP950454亚细胞定位示意图。ER代表内质网

图3
SVSP454蛋白的亚细胞分布*环状木霉*-受感染的细胞。面板I至V表示SVSP454蛋白在相应细胞培养通道（F10、F20、F55、F110和F165）中的亚细胞分布*环状木霉-*感染细胞。面板VI和VII显示了*环状木霉-*感染细胞。SVSP454蛋白（第一组到第五组）和TaSP蛋白（第六组）用兔抗SVSP454TaSP多克隆抗体染色，分别以1:100的比例稀释，然后用山羊抗兔抗体结合Alexa Fluor 488以1:1000的稀释度培养细胞。以1:2000的稀释度使用Hoechst 33342标记细胞核，以1:100的稀释度用Alexa Fluor™594卵磷脂对细胞骨架进行染色。共焦显微镜观察SVSP454的亚细胞定位

图5
使用Y2H系统筛选与SVSP454相互作用的蛋白质。一诱饵质粒（pGBKT7-SVSP454）在Y2H-Gold细胞中的自激活能力和毒性的检测。b条pGBKT7-SVSP454诱饵质粒转化效率的鉴定。采用SVSP454的特异性引物，随机选择菌落并进行菌落PCR鉴定。M： DL 2000 DNA标记；1–18：菌落在带有SVSP454诱饵质粒的SDO板上生长。**c（c）**筛选与SVSP454诱饵质粒相互作用的假定猎物蛋白。诱饵质粒和被捕食质粒的共转化产物分别在DDO/X/A和QDO/X/A平板上生长。将SVSP950454诱饵和pGBKT7空质粒转化为Y2H Gold细胞，并在不同的平板上培养。将阴性对照（pGADT7-T和pGBKT7-Lam）质粒和阳性对照（pGADT7-T和pGBKT7-53）质粒共转化为Y2H-Gold细胞，并在30°C下在DDO和DDO/X/A板上孵育

图6
SVSP454及其猎物蛋白（CCDC181和MRPL30）在HEK293T细胞中的表达和亚细胞定位。SVSP454（4µg）及其潜在相互作用蛋白CCDC181一或成对（SVSP454（2微克）-CCDC181（2微格）和SVSP454[2微克]-MRPL30[2微格]），b条转染到HEK293T细胞，用小鼠抗MYC标记单克隆抗体或兔抗FLAG标记单抗染色，并用山羊抗小鼠Alexa Fluor 488-或驴抗兔594-结合抗体孵育。细胞核用Hoechst 33342染色

图7
SVSP454与CCDC181和MRPL30相互作用。共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹（IB）鉴定表达SVSP454-MYC（10µg）的HEK293T细胞及其潜在的相互作用蛋白标记的CCDC181（10μg）(一)和SVSP454-MYC（10µg），以及标记有FLAG的MRPL30（10μg）(b条). WCL代表无IP的整个HEK293T细胞裂解物的IB分析

图8
SVSP454在单元上下文中绑定到CCDC181和MRPL30。一BiFC分析的重组质粒构建示意图。VN和VC融合到SVSP454及其相互作用蛋白（CCDC181和MRPL30）的C末端，每个融合蛋白的N末端也包含一个FLAG或HA标签。b条如图所示，在HEK293T细胞中单独或成对表达SVSP454-VN、SVSP454-VC、CCDC181-VN、CCDC81-VC、MRPL30-VN、MRPL30-VC、SVSP4.54-VN-CCDC181-VC、SVSP45 4-VN-MRPL30-VC、SVSPS454-VC-CCDC181-VN和SVSP454-1VC-MRPL30-VN。将4微克质粒转染到HEK293T细胞中。通过流式细胞术检测BiFC荧光信号的MFI，并将其表示为相对于对照HEK293T细胞信号的MFI值。误差条表示三个独立的BiFC实验的SD。**c（c）**HEK293T细胞与SVSP454-VN-CCDC181-VC（4μg）、SVSP454-VN-MRPL30-VC（4μg/对）、SVSPS454-VC-CCDC181-VN（4μg.对）和SVSP454-VC-MRPL30-VN（4微克）共转染。空载体pBiFC-VN173（4μg）和pBiFC-VC155（4微克）作为阴性对照，分别转染HEK293T细胞

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[4] Sivakumar T，Hayashida K，Sugimoto C，Yokoyama N。泰勒虫的进化和遗传多样性。感染基因进化。2014年；27:250–263. doi:10.1016/j.meegid.2014.07.013。-内政部-公共医学

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