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.2021年6月2日；12(6):570.
doi:10.1038/s41419-021-03853-y。

SLC7A2缺乏通过增强髓源性抑制细胞的募集促进肝细胞癌的进展

苏洪霞 1 2, 吴敬文 1 2, 王东周 1 2, 张明宇（Mingyu Zhang） 1 2, 赵凯（Kai Zhao） 1 2, 刘京梅 1 2, 田院长 三 4, 廖家之 5 6
附属公司

SLC7A2缺乏通过增强髓源性抑制细胞的募集促进肝细胞癌的进展

苏洪霞等。 细胞死亡病. .

摘要

肝癌患者预后不良的主要原因是高转移和复发。癌症的进展取决于肿瘤支持性的微环境。因此，阐明肿瘤免疫在潜在肝癌转移中的机制至关重要。在这里，我们报道了溶质载体家族7成员2（SLC7A2）在肝癌转移中的新作用。SLC7A2的减少是肝癌患者生存的一个独立且显著的危险因素。SLC7A2的上调降低了肝癌的侵袭和转移，而SLC7O2的下调促进了肝癌的浸润和转移。我们进一步发现，缺陷的SLC7A2通过PI3K/Akt/NF-kκB通路药物上调CXCL1，招募髓源性抑制细胞（MDSC），发挥肿瘤免疫抑制作用。此外，我们发现G9a介导的H3K9二甲基化（H3K9me2）沉默SLC7A2的表达，以抑制肝癌转移和免疫逃逸。总之，G9a介导的SLC7A2沉默通过CXCL1分泌和MDSC募集培养肿瘤支持微环境，在癌症转移中发挥了意想不到的作用。因此，SLC7A2可能为MDSC的致癌特性提供了新的机制。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。SLC7A2在HCC组织中显著下调，SLC7O2缺乏提示预后不良。
一个TIMER网站上SLC7A2在不同癌症类型中的表达。B类TCGA和GEO数据库上SLC7A2 mRNA表达的生物信息学分析。（TCGA、GSE101685、GSE84402分别含有50、7、14个正常组织和374、24、14个肝癌组织）。C86对肝癌和邻近非肿瘤组织中SLC7A2 mRNA的相对表达。D类Western blot分析SLC7A2在八对人类肝癌样本和配对的相邻非肿瘤组织中的表达。E类SLC7A2的IHC染色代表性图像。肝癌队列中SLC7A2的IHC评分。比例尺，200 µm（上部），50 µm（更低）。F类肝癌队列中SLC7A2表达与总生存率相关性的Kaplan-Meier分析。G公司根据TIMER和Kaplan-Meier Plotter网站上肝癌组织中SLC7A2的表达水平，对总生存率的Kaplan-Mieer分析进行比较。所有数据均显示为平均值 ± 标准差*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001, ****P（P） < 0.0001.
图2
图2。SLC7A2的破坏在体内外促进肝癌的增殖、侵袭和转移。
一个,B类SLC7A2在正常肝组织和肝癌细胞系中的相对mRNA和蛋白表达。CWestern blotting分析慢病毒转染后，在Huh7和MHCC97H细胞中表达SLC7A2。D类,E类缺乏SLC7A2促进体外肝癌细胞增殖。D类SLC7A2对肝癌细胞集落形成的影响。E类采用CCK-8法检测SLC7A2对肝癌细胞增殖的影响。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.F类–L（左）SLC7A2缺乏可促进体内肝癌细胞的生长和迁移。F类增长曲线和G公司C57BL/6中肿瘤的重量曲线(n个 = 每组10只小鼠）。H（H）指示肿瘤中Ki67的IHC染色。我显示了具有代表性的生物发光图像和总光子通量。J型不同组的肺转移发生率和转移结节数。K（K）C57BL/6小鼠的总生存时间。L（左）来自不同地区的H&E染色肺组织的代表性图像。比例尺代表1 mm（上面板）和100 μm（下面板）。数据显示为平均值 ± SD*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图3
图3。低SLC7A2诱导CXCL1分泌和MDSC浸润。
一个,B类qRT-RCR和ELISA检测人肝癌细胞CXCL1水平。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.CqRT-RCR检测CXCL1在Hepa1-6-shSLC7A2荷瘤小鼠肿瘤中的表达(n个 = 5） 。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验**P（P） < 0.01.D类皮下肿瘤和荷瘤小鼠血液中CXCL1的ELISA检测。(n个 = 5） 。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, ****P（P） < 0.0001.E类标记的CD11b+等级-1+采用荧光激活细胞分选（FACS）法检测Hepa1-6荷瘤小鼠骨髓样MDSC。F类MDSC迁移示意图。G公司将Hepa1-6-shSLC7A2及其对照克隆的条件培养基（CM）放置在下室中。新鲜髓样MDSC被放置在上腔并侵入24个 h.统计总数。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.H（H）用mCXCL1（010100）预处理 纳克/毫升，24 h） ，显示了小鼠MDSC的趋化性。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验****P（P） < 0.0001.我人肝癌组织中SLC7A2和CD11b的代表性IHC染色图像。比例尺，200 µm（上部），50 µm（更低）。J型肝癌队列中MDSC浸润与总生存率之间关系的Kaplan-Meier分析。数据显示为平均值 ± SD**P（P） < 0.01.
图4
图4。使用抗Gr-1的MDSC的耗竭抑制低SLC7A2介导的HCC转移。
一个皮下注射Hepa1-6-shcontrol或Hepa1-6-2shSLC7A2细胞并用抗Gr-1抗体（400 μg/体）或IgG，从接种肿瘤后第1天起每周两次。n个 = 10B类第27天用抗Gr-1抗体或IgG处理的皮下Hepa1-6-sh对照细胞或Hepa1-6-2shSLC7A2细胞的流式细胞术图像。CD8（CD8）+T细胞（上部）和MDSCs（下部）。C流式细胞术分析CD8的比率+第27天各组之间的T细胞和MDSC，n个 = 10.数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验**P（P） < 0.01.D类–H（H）体内实验表明，MDSC的缺失可以抑制SLC7A2介导的肝癌转移的丢失。D类在不同的组中显示了具有代表性的生物发光图像，这些图像是用抗Gr-1抗体或C57BL/6中的IgG注射肝脏中的指示细胞处理的，n个 = 10E类肿瘤在指定时间点的生物发光强度表示为总光子通量。F类C57BL/6小鼠肺转移的发生率和肺转移结节的数量。n个 = 10G公司各组小鼠的总体存活率。H（H）典型的H&E染色肺转移结节。比例尺代表1 mm（上面板）和100 μm（下面板）。数据显示为平均值 ± SD*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01.
图5
图5。低SLC7A2通过反式激活P65表达上调CXCL1表达。
一个Western Blotting the SLC7A2，phosphalized P65 at ser536（第65页序列536)以P65、P50、p-IKBα、IKBα和β-actin为对照。B类用qRT-PCR检测NF-kκB抑制剂JSH-23（10 μm，24 h） ●●●●。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.CELISA检测经NF-κB抑制剂JSH-23（10 微米，24 h） ●●●●。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.D类分析磷酸化P65在Huh7-shSLC7A2细胞和MHCC97H-SLC7O2细胞的细胞核和细胞质部分的表达。层粘连蛋白B1和β-肌动蛋白分别作为对照。E类萤光素酶报告基因测定显示在用pCMV-SLC7A2和CXCL1启动子萤光素酶构建体共转染的指示物中。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验**P（P） < 0.01.F类截短和突变的CXCL1启动子构建物与PCMV-SLC7A2共转染，并证实了相对荧光素酶活性。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.G公司ChIP分析证实了肝癌细胞中P65与CXCL1启动子的直接结合。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.H（H）ChIP分析证实P65与人类肝癌组织中的CXCL1启动子直接结合。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.我p-P65的免疫荧光序列536显示HCC细胞的数量。J型用PI3K、JNK、ERK、p38、STAT3抑制剂处理Huh7-shSLC7A2细胞，然后用western blotting检测SLC7O2和p-P65的表达序列536以及AKT、ERK、JNK、p38、STAT3的总表达和磷酸化表达。
图6
图6。CXCR2拮抗剂治疗可抑制SLC7A2介导的低肝癌转移。
一个,B类将来自Hepa1-6克隆的条件培养基（CM）置于不同浓度SB265610（01001000）的下室中 纳克/毫升，24 h） ●●●●。新鲜髓样MDSC被放置在上腔并侵入24个 h.统计总数。比例尺代表100 微米。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.C用mCXCL1（10）预处理 纳克/毫升，24 h） 和SB265610（100 纳克/毫升，24 h） ，显示了小鼠MDSC的趋化性指数。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.D类皮下注射Hepa1-6-shcontrol或Hepa1-6-2shSLC7A2细胞并用CXCR2拮抗剂（SB265610:2）治疗的小鼠肿瘤生长 mg/kg体重）或PBS，从接种肿瘤后第1天开始每周六次。n个 = 10E类第27天用SB265610或PBS处理的皮下Hepa1-6-sh对照细胞或Hepa1-6-shSLC7A2细胞的流式细胞术图像。CD8（CD8）+T细胞（上部）和MDSC（下部）。流式细胞术分析CD8的比率+分别在第27天组间的T细胞和MDSC，n个 = 10.数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，以及***P（P） < 0.001.F类小鼠肿瘤细胞中CD11b、CD8和颗粒酶B蛋白表达模式的免疫荧光染色。G公司–K（K）体内试验表明，SB265610的治疗可以阻断SLC7A2介导的HCC转移。G公司在不同的组中显示了具有代表性的生物发光图像，用SB265610或PBS处理C57BL/6中的指示细胞注射肝脏，n个 = 10.肿瘤在指定时间点的生物发光强度表示为总光子通量。H（H）肺转移发生率我C57BL/6小鼠肺转移性结节的数量。n个 = 10J型各组小鼠的总体存活率。K（K）典型的H&E染色肺转移结节。比例尺代表1 mm（上面板）和100 μm（下面板）。所示图像代表了至少三个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图7
图7。G9a抑制剂UNC0642抑制SLC7A2介导的肝癌免疫逃逸、侵袭和转移。
一个,B类5-aza（2）处理MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞 μm，3天），EPZ-6438（1 μm，3天），UNC0642（5 μm，2天），ITF-2357（1 μm，3天），然后用qRT-RCR和western blotting检测SLC7A2的表达。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.CChIP-定量实时PCR分析检测G9a抑制剂UNC0642治疗后H3K9me2与SLC7A2基因的相关性。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验**P（P） < 0.01.D类人类肝癌组织中SLC7A2和G9a的代表性IHC染色图像。比例尺，200 µm（上），50 µm（更低）。E类人类肝癌组织TCGA数据库中G9a mRNA表达的生物信息学分析。F类肝癌队列中G9a表达与总生存率相关性的Kaplan-Meier分析。G公司–我UNC0642在体外促进肝癌细胞增殖和转移。G公司UNC0642在肝癌细胞集落形成中的应用。H（H）采用CCK-8法检测UNC0642对肝癌细胞增殖的影响。我Transwell分析显示了迁移和入侵的能力。比例尺代表100 μm。J型使用蛋白质印迹检测用UNC0642处理的MHCC97H和HCCLM3细胞中G9a、SLC7A2及其下游靶基因的表达。数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验*P（P） < 0.05.K（K）,L（左）皮下注射H22-control或H22-SLC7A2细胞的小鼠肿瘤生长，每天5点通过腹腔注射UNC0642治疗 每3天监测一次肿瘤体积。n个 = 5M（M）第27天用UNC0642或其对照处理的皮下H22-control或H22-SLC7A2细胞的流式细胞术图像。CD8（CD8）+T细胞（上部）和MDSC（下部）。流式细胞术分析CD8的比率+第27天各组间的T细胞和MDSC，n个 = 5.数据显示为平均值 ± SD来自至少三个独立实验**P（P） < 0.01.N个小鼠肿瘤细胞中CD11b、CD8和颗粒酶B蛋白表达模式的免疫荧光染色。比例尺，20 微米。O（运行）–R（右）体内实验表明，UNC0642治疗可以阻断SLC7A2介导的肝癌转移。O（运行）在不同的组中显示了具有代表性的生物发光图像，在BALB/C中用UNC0642或DMSO处理，注入肝脏中的指示细胞和肺转移的发生率，n个 = 10.肿瘤在指定时间点的生物发光强度表示为总光子通量。P（P）BALB/C小鼠肺部转移性肺结节的数量。n个 = 10问各组小鼠的总体存活率。R（右）典型的H&E染色肺转移结节。比例尺代表1 mm（上面板）和100 μm（下面板）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.S公司肝癌免疫逃避中SLC7A2信号的示意图。SLC7A2缺乏通过PI3K/Akt/NF-κB途径上调CXCL1的表达。CXCL1通过招募MDSC到肿瘤中来促进肝癌的生长和转移。中和或抑制MDSC浸润可消除SLC7A2缺陷介导的肝癌生长和转移。使用G9a抑制剂（UNC0642）抑制SLC7A2减数化HCC转移的丢失。
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