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.2021年6月9日10:e63972。
doi:10.7554/eLife.63972。

HP1α是一种控制核和有丝分裂染色体机制的染色质交联剂

艾米·斯特罗姆 # 1, 罗纳德·比格斯 # 2, 爱德华·巴尼根 # 三, 王晓涛 4, 凯瑟琳·邱 5, 卡梅隆·赫尔曼 2, 吉梅娜·科拉多 2, 冯岳 4 6, 琼·C·里特兰·波利茨 7, Leah J Tait（Leah J泰特） 7, 大卫·斯卡尔佐 7, 艾格尼斯·特林 7, 马克·格罗丁 7, Clifford P Brangwyne公司 1, 约翰·F·马可 2 8, 安德鲁·斯蒂芬斯 5
附属公司

HP1α是一种控制细胞核和有丝分裂染色体机制的染色质交联剂

艾米·斯特罗姆等。 埃利夫. .

摘要

染色质由DNA和相关蛋白质组成，包含遗传信息，是细胞核的机械组成部分。异染色质组蛋白甲基化控制细胞核和染色体硬度，但异染色素蛋白HP1α（CBX5）的作用尚不清楚。我们使用一种新的HP1α生长素诱导的脱细胞人细胞系来快速降解HP1α。降解不会改变转录、局部染色质致密化或组蛋白甲基化，但会降低染色质硬度。单核微操作表明，HP1α对基于染色质的机制至关重要，并与组蛋白甲基化分离，保持核形态。二聚不足HP1α的进一步实验公元1165年表明通过HP1α二聚化的染色质交联是关键的，而聚合物模拟证明了染色质-染色质交联剂在力学中的重要性。在有丝分裂染色体中，HP1α同样支持僵硬，同时有助于有丝分裂排列和忠实分离。因此，HP1α是一种关键的染色质交联蛋白，在整个细胞周期中为染色体和细胞核提供机械强度，并支持细胞功能。

关键词：HP1a；细胞生物学；染色体；染色体；基因表达；异染色质；人；力学；有丝分裂；核心。

PubMed免责声明

利益冲突声明

AS、RB、EB、XW、KC、CH、JC、FY、JR、LT、DS、AT、MG、CB、JM、AS未宣布竞争性权益

数字

图1。
图1.CRISPR内源性HP1α-生长素诱导的表皮生长因子sfGFP细胞系的生成。
(A类)HP1α-AID-sfGFP相对于野生型细胞的示例图像，通过免疫荧光以及Hoechst DNA染色和相位对比图像进行HP1α染色。比例尺=20μm。(B类)生长素治疗前、4小时后和去除生长素后2天的HP1α-AID-sfGFP图像示例。Hoechst DNA染色有助于标记细胞核。(C类)Western blot和(天)对照（ctrl/未处理）、生长素处理4小时、去除生长素后2天和野生型（WT）的GFP强度的流式细胞仪图显示HP1α-AID sfGFP的短期损失和恢复。 (E类)RNA-seq数据图显示，由q值<0.05确定的少数基因改变转录水平（通过-Log计算10P） 和Log的绝对变化2fold>1（标记为橙色），在16663个基因中，只有40个基因的表达在对照组/未处理组与4小时处理组之间发生显著变化。
图1——图补充1。
图1-图补充1。HP1α降解后，局部染色质压实仍然存在。
(A、 B类)添加(A类)+生长素或(B类)-生长素控制。比例尺=10μm。平均值图表(C类)染色质致密化(天)HP1α-AID-sfGFP强度，以及(E类)对照组H2B强度（生长素，黑线）和HP1α降解（生长激素，灰线）。N=3个试验，N=20、20、20个核/试验，总N=60个核。
图2。
图2.HP1α是控制细胞核形状的一种机械成分，与组蛋白甲基化不同。
(A类)通过透射光和HP1α-AID-sfGFP荧光和单核微操作力扩展测量实验获得的单个孤立核的示例图像。拉吸管延伸细胞核，而预测力吸管的弯曲提供力测量。比例尺=10μm。(B类)微操作力延伸控制（黑色）和生长素诱导的HP1α降解（橙色）的示例轨迹提供了斜坡上的核弹簧常数测量值（虚线）。初始斜率提供基于染色质的核弹簧常数，而第二个斜率提供了基于层压板的应变硬化核弹簧常数。(C和D)基于平均和单染色质的核弹簧常数图(C类)亲本细胞系控制和4-6小时生长素处理(天)HP1α-AID-sfGFP，有或没有生长素和/或甲基stat处理。n=11-18个核。(E类)使用和不使用生长素和/或甲基stat处理的细胞的示例图像。(F类)HP1α-AID-sfGFP和异染色质标记H3K9me的定量相对荧光2,3. (G公司)定量异常核形态确定为固体值小于0.96，经二次方分析统计。另一种量化异常核形态的方法是通过图2中图补遗2中报告的平均核曲率。三个生物实验（显示为黑点），每个实验由n=109、102105个对照组组成；n=137，115，165生长素，n=31，34，32甲基stat，n=102，92，78生长素甲基stat。对照组、methystat和生长素的平均测量值相似，甲基stat为0.971±0.0001，但生长素为0.969±0.0015，p=0.005。p值报告为*<0.05，**<0.01，***<0.001，无星号表示无显著性，p>0.05。误差条表示标准误差。
图2-图补充1。
图2-图补充1。HP1α降解后，层压板力学和水平不会发生变化。
(A类)应变硬化核弹簧常数测量为长延伸力延伸斜率减去短延伸力延伸（基于染色质）斜率。每种情况下n>9。该数据与图2中所示的力数据同时采集。(B类)生长素和/或甲基stat处理后，层粘连蛋白A/C和层粘连蛋白质B1水平的平均相对荧光图。对于层粘连蛋白A/C和H2B N=3实验，其中总N是未经处理的HP1α-AID-sfGFP（-/-）N=91，生长素（+/-）N=81，甲基stat（-/+）N=87，以及甲基stat生长素N=90。对于层粘连蛋白B1，该数据与图2、E和F中的数据一起获得，其中报告了n值。p报告值为*<0.05，**<0.01，***<0.001。(C类)示例图像。(天)正常化为父母对照，H3K9me的免疫荧光信号2,3对于亲本和HP1α-AID-sfGFP修饰细胞系，未经或经生长素处理16小时和/或甲基stat处理48小时；±n=307324215-/+n=188115155+/+n=184258284；HP1α-AID-sfGFP-/-n=108101104；±n=136114164-/+n=30、33、31+/+n=102、91、77。(E类)H3K9me的归一化免疫荧光2,3和H3K9ac在HP1α-AID-sfGFP-或+生长素中放置4天（96小时），用于6个实验重复物-生长素（218、246、263、186、238、265）和+生长激素（188、184、174、208、199、187）。p值报告为*<0.05，**<0.01，***<0.001，无星号表示无显著性p>0.05，通过学生的t检验计算。误差条表示标准误差。
图2——图补充2。
图2-图补充2：核曲率增加与间期HP1α损失一致。
表达H2B-miRFP的U2OS HP1α-AID-sfGFP单细胞随时间的平均核曲率图(A类)没有生长素和(B类)添加了生长素。显著（>0.05μm）的细胞核百分比−1曲率变化）和稳定（超过三个时间点）变化的形状表示在右下角。的柱状图(C类)未经处理（ctrl）和(天)在第1、5、12小时，生长素处理的（辅助）核曲率。虚线表示核形状异常（曲率>0.175μm−1)，右上角的数字是异常细胞核的百分比。(E类)在时间零点添加生长素（灰色）和（黑色）时，随时间变化的平均种群核曲率。误差条代表标准误差，每个条件n=42个核。(F类)用生长素处理的单核随时间变化的示例图像显示，在间期中失去正常的椭圆形态。p报告值为*<0.05，**<0.01，***<0.001，通过学生的t检验计算。
图2——补充图3。
图2补充图3。HP1α降解的细胞核显示核破裂，DNA损伤增加，有丝分裂后核形态异常。
(A类)用生长素处理细胞4小时后，NLS-RFP HP1α-AID-sfGFP延时成像的代表性图像显示，核形状的丢失也会导致核破裂和核分隔的丢失。右下角表示第一张图像之后的分钟。(B–D类)对16小时的HP1α-AID-sfGFP细胞-/+生长素进行DNA损伤标记物H2AX成像。(B类)有代表性的图像显示细胞核有Hoechst DNA染色、HP1α-AID-sfGFP和ϒH2AX。(C类)平均ϒH2AX焦点和(天)每个核的ϒH2AX病灶16小时/+生长素直方图。对照组（110、189、112、155）和生长素处理16小时（145、89、94、97）进行了四次重复实验。p报告值为*<0.05、**<0.01、***<0.001，通过学生t检验计算。误差条表示标准误差。比例尺代表10μm。
图3。
图3 HP1α二聚化对维持核形状至关重要。
(A类)HP1α-AID-sfGFP细胞对照组（-Aux）和生长素处理组（+Aux）的示例图像，分别使用和不使用标记有mCherry的外源性HP1α野生型（WT）或二聚体突变体（I165E）救援构建物。比例尺=10μm。(B类)以黑点表示单个试验的平均核曲率测量图。(C类)大于0.15μm的异常形状细胞核百分比图−1曲率，即未处理细胞核的平均值加上标准偏差。针对由生长素组成的每个条件（用黑点表示），测量了八个实验生物复制品，n=37、45、45、57、58、57、55、54；+生长素，n=60，44，41，60，60，60,60，60；+生长素和WT外源性救援，n=27，30，36，60，60，60,60，19；+生长素和I165E外源性救援，n=38、40、50、59、56、58、58、51。p值报告为无星号>0.05、*<0.05、**<0.01、**<0.001，通过单向方差分析计算。误差条表示标准误差。
图4。
图4.核机械反应的模拟和外周异染色质的实验测量支持HP1α作为染色质-染色质交联剂的模型。
(A类)具有不同染色质层（壳）连接水平的模拟细胞核的力应变关系。颜色表示与叶片相连的染色质片段的不同百分比。嵌入式：去除一部分薄片（绿色）的模拟快照，以显示两种不同拉伸力下的内部染色质（蓝色），F类. (B类)短延伸区和长延伸区的弹簧常数，用于模拟不同水平的染色质-薄片交联，通过与外壳相连的外周染色质亚基百分比进行量化（分别为蓝色和红色）。(C类)具有不同程度染色质-染色质交联的模拟细胞核的力-应变关系。(天)不同染色质-染色质交联水平（蓝色和红色）的短延伸和长延伸弹簧常数。垂直虚线(A类)和(C类)将短期扩展和长期扩展区分开。每个力应变数据点(A类)和(C类)是根据n≥11模拟计算的平均值。短伸长弹簧常数(B类)和(天)都是从n开始计算的短的≥13和10个力伸长数据点。长伸长弹簧常数(B类)和(天)都是从n开始计算的长的≥19和15个力伸长数据点。(E类)未经处理或经生长素处理的HP1α-AID-sfGFP细胞核的示例图像分析(F类)富集测量（外周/内部平均信号），以确定DNA（Hoechst）、HP1α和H3K9me的外周富集2,3.p值表示为n.s.>0.05和****<0.0001，通过单向方差分析计算。中的误差线(A类)-(天)显示平均值的标准误差。
图5。
图5 HP1α是有丝分裂染色体的一个机械成分，有助于有丝分裂中的正确分离。
(A类)使用微量移液管从活细胞中分离有丝分裂染色体的步骤示例图像。(B类)通过相位对比和HP1α-AID-sfGFP荧光强度对代表性活有丝分裂细胞和分离的有丝分裂染色体束进行成像。通过测量细胞或染色体束的荧光减去背景荧光计算的值，归一化为未经处理的细胞HP1α荧光强度的平均强度。p值报告为***<0.001，通过学生的t检验计算。(C类)裂解细胞外孤立有丝分裂束的内源性HP1α-AID-sfGFP荧光的示例图像。黄色方框表示绘制图形线扫描的区域。行扫描显示染色体臂上有HP1α。(天)力拉伸实验的示例图像。右移液管从左移液管中抽出，从而拉伸染色体并使左移液器偏转。左侧“力”吸管具有预先测量的弯曲常数（单位：pN/um），用于计算力。左图为不同条件下的力延伸实验痕迹示例。(E类)每种条件下的平均倍增力（100%应变）图，单位为微微牛顿，由力延伸轨迹的斜率和初始染色体长度决定。对于B-E，n=20用于对照和生长素处理，n=16用于甲基stat，n=14用于生长素甲基stat处理，p值通过学生t检验计算。(F类)通过后期桥接或不分离的异常有丝分裂分离的示例图像。对照未处理细胞（-）或生长素处理细胞（+）在4或16小时内出现后期桥或非分裂/非整倍体，有丝分裂细胞显示异常中期错位（黑条）和后期/末期错位（白条）的百分比图。中期错位三到四个生物复制实验（黑点），包括n=16、15、20、37-辅助，n=33、33、24+辅助4小时，n=22、48、58、54+辅助16小时。后期和末期错位3-4个实验（黑点子），包括n=29、23、30、30-辅助，n=32、29、18+辅助4个小时，n=20、35、36、，45+辅助16小时p值报告为*<0.05，**<0.01，***<0.001，***<0.0001，通过Student t检验计算。(G公司)通过有丝分裂追踪24小时HP1α-AID-sfGFP细胞-生长素或+生长素，以确定异常有丝分裂是否导致通过核曲率测量的子核形状异常（17个有丝分裂中的亲本34个核；23个有丝裂中的-生长蛋白46个核；26个有丝分化中的+生长蛋白51个核，单向方差分析中的p值）。异常有丝分裂百分比如图5补充图1D所示。误差条表示标准误差。A-C中的比例尺=10μm，F=20μm。
图5——图补充1。
图5补充图1。HP1α-AID-sfGFP显示细胞和染色体荧光，降解后出现有丝分裂错误，导致细胞核曲率增大。
(A类)对有丝分裂细胞和分离的有丝分裂染色体束之间的HP1a-AID-sfGFP总荧光计数进行了比较，我们以10倍的曝光时间和相同功率对未经处理的生长素4小时、甲基化酶2天和生长素+甲基化酶进行了成像。(B类)在分离的染色体束中用HP1α-AID-sfGFP修饰的整条染色体的示例图像。(C类)与SiR-Hoechst标记相关的HP1α-AID-sfGFP体内共焦成像显示了着丝粒周围病灶的浓度。(天)通过有丝分裂追踪亲本细胞系HP1α-AID-sfGFP 24小时-生长素和+生长素处理细胞的正常或异常行为（也在图5G中报告）。该数据是根据主图5G所示的相同数据进行分析的，该图显示了核曲率子核。
图6。
图6 HP1α是间期核和有丝分裂染色体的机械元件。
在野生型（WT）细胞核中，HP1α起着染色质-染色质交联剂的作用，导致核力学更加坚硬。其他有助于核力学的成分包括染色质聚合物（其机械作用由组蛋白甲基化决定）、层和染色质-层之间的连接。HP1α降解的细胞核具有异常形状和基于较软染色质的短延伸机械反应。HP1α的降解还导致有丝分裂染色体变软和有丝分裂缺陷，包括染色体错位和后期桥。
作者回复图片1。
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作者回复图片2..A。
亲代U2OS抗HP1α抗体染色显示其内源性定位于异色区和核仁周围。B.在表达外源性C末端标记HP1α-mCherry的亲本U2OS中用抗HP1α进行抗体染色，在核仁周围和异色区显示类似的定位。C.在HP1α-GFP-AID C-末端标记的细胞系中用抗HP1α进行抗体染色，显示抗体和GFP标签之间的共定位，并且在核仁周围正常定位。D.N-末端标记的外源mCherry-HP1α和内源性标记的HP1α-GFP-AID的共表达显示N-末端和C-末端标记的群体之间的蛋白质定位没有差异。E.C末端标记的外源性HP1α-mCherry和内源性标记的HP1α=GFP-AID的共表达表明内源性和外源性C末端标记蛋白之间的蛋白定位没有差异。
作者回复图片3。
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