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.2021年5月11日；35(6):109101.
doi:10.1016/j.celrep.2021.109101。

染色质可及性控制癌症和T细胞对精氨酸饥饿的不同反应

尼古拉斯·T·克拉姆 1, 安德烈亚斯·哈吉尼科劳 2, 蒙霞 2, 约翰·沃尔斯比挠痒痒 三, 乌齐·吉莱迪 2, 陈纪丽 2, Mashiko Setshedi公司 2, 拉尔斯·奥尔森 4, 刘一军（I-Jun Lau） 1, 劳拉·戈弗雷 1, 林恩·奎克 5, Zhanru余 6, 埃里卡·巴拉比奥 1, 迈克·巴恩科布 2, 乔治·纳波利塔尼 2, 马里奥利娜·萨利奥 2, 哈希姆·库伊 2, Benedikt M Kessler公司 6, 斯蒂芬-泰勒 7, 帕雷什·维亚斯 1, 詹姆斯·S·O·麦库拉 三, 托马斯·米尔恩 8, 文森佐·塞隆多洛 2
附属公司

染色质可及性控制癌症和T细胞对精氨酸饥饿的不同反应

尼古拉斯·T·克拉姆等。 单元格代表. .

摘要

耗尽精氨酸等重要营养物质的微环境是癌细胞逃避免疫的关键策略。许多肿瘤过度表达精氨酸酶，但尚不清楚这些肿瘤（而不是T细胞）如何耐受精氨酸缺乏。在本研究中，我们发现肿瘤细胞通过上调精氨琥珀酸合成酶1（ASS1）从瓜氨酸合成精氨酸。在精氨酸饥饿下，ATF4和CEBPβ与ASS1内的增强子结合，诱导ASS1转录。尽管存在活性ATF4和CEBPβ，但T细胞不能诱导ASS1，因为该基因被抑制。精氨酸饥饿导致全球染色质致密化和抑制组蛋白甲基化，从而破坏ATF4/CEBPβ结合和靶基因转录。我们发现在精氨酸缺乏的情况下，T细胞的活化受到损害，与不完全染色质重塑和关键基因的调控不当相关的代谢紊乱显著。我们的研究结果强调了由营养应激介导的T细胞行为，癌症细胞利用其实现病理性免疫逃避。

关键词：ASS1；ATF4；H3K27me3；T细胞染色质；精氨酸；肿瘤代谢；免疫代谢；免疫抑制；代谢调节；营养应激。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明T.A.M.和P.V.是OxStem Ltd.的子公司OxSten Oncology（OSO）的创始股东。M.Salio为Nucleome Therapeutics Ltd.提供咨询。其余作者声明没有竞争利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
T细胞和THP1细胞对精氨酸饥饿表现出不同的反应（A）左侧：受刺激CD4的生长+在含有（−Arg+Citr）或不含（−Arg）瓜氨酸的完整（+Arg）或无精氨酸培养基中培养的人T细胞。数据表示为平均值±SD；n=4。右：刺激原始、中央记忆（Tcm）和效应记忆（Tem）T细胞（排序策略见图S1D），然后在指定的培养基中培养96小时并计数。数据是0小时时细胞数的倍数增加；平均值±SD；n=2。（B） THP1细胞在指定培养基中的生长。数据表示为平均值±SD；n=4。（C） 健康（对照）患者血浆和AML患者血浆或骨髓中瓜氨酸的浓度。中心栏显示平均值±SD。∗∗∗∗p<0.0001（未配对t检验）。（D） 在+Arg或−Arg培养基中培养72小时的THP1或刺激T细胞中mRNA的微阵列分析。每个柱代表一个复制。指示了基因的类别分配（I–VI）。（E） T细胞和THP1细胞中差异表达基因的重叠，显示类别分配（I–VI）。（F） 精氨酸饥饿后各类差异表达基因中KEGG途径富集分析，如（D）所示。点大小与显著性成正比（Wallenius方法）。另请参见图S1和表S1和S2。
图2
图2
ATF4诱导的ASS1系统上调促进THP1细胞依赖瓜氨酸的生长（A）精氨酸吸收和生物合成的关键蛋白。（B） 基于微阵列分析显示基因表达变化的森林图（见图1D）。水平条显示四分位范围。（C）ASS1系统和ATF4型在来自健康供体的原代AML母细胞或未转化的单核细胞和骨髓细胞中的表达（Quek等人，2016）。样品由捐赠者着色。条形图显示平均值±SD。∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001（Mann-Whitney检验）。（D） 在完全培养基（+）、含有20μM精氨酸（低）或缺乏精氨酸的培养基（-）中培养72 h的受刺激T细胞和THP1细胞中ASS1和ATF4的Western blot。为了清晰起见，显示了ASS1斑点的两次曝光。五个重复的代表。（E） 相对于+Arg T细胞，归一化为GAPDH的（D）定量。为了清晰起见，T细胞中的表达以较小的比例显示。数据表示为平均值±SEM；n=5。∗p＜0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001（Dunnett多重比较试验）。ns，不显著。（F） 对照（NT）THP1细胞生长或KD后ASS1系统或ATF4型在指定的媒体中。数据表示为平均值±SD；n=4。（G） 对照（NT）THP1细胞或KD后ASS1和ATF4的代表性western blotASS1系统或ATF4型在有（+）和无（−）精氨酸的情况下维持72小时。右：定量，相对于+Arg NT细胞归一化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM；n=3。∗p<0.05（Dunnett多重比较试验）。（H） CTV标记的CD8+T细胞用GFP公司-ASS1系统共表达质粒。96小时后，在指定的培养基中分析细胞的GFP和CTV水平。显示了三个技术副本。（一） （H）分析中GFP阳性细胞的比例，归一化为−Arg比率。数据表示为平均值±SD；来自两个捐赠者的n=5。∗∗p<0.01（配对t检验）。另请参见图S2。
图3
图3
ATF4激活ASS1系统通过内含子增强子转录（A）ATF4和CEBPβ的参考规范化ChIP-seqASS1系统在所示培养基中培养72小时的受刺激T细胞和THP1细胞中，以及+Arg培养基中THP1电池中H3K4me3、H3K27ac和H3K4me1的ChIP-seq中（Godfrey等人，2019年）。灰色条显示qPCR引物的位置。（B） ATF4和CEBPβ的参考标准化ChIP-seqSLC7A1型，如（A）所示。（C） 亲本（野生型[WT]）和突变THP1细胞中增强子区域的序列。PAM序列下划线。（D） 在+Arg或−Arg培养基中培养72 h，对WT和突变THP1细胞中的ATF4和H3K27ac进行ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM；n=3。（E） WT和突变THP1细胞中ASS1和ATF4的Western blot，在+Arg或−Arg培养基中培养72小时。三个重复的代表。（F） WT和突变THP1细胞的生长，在指定的培养基中培养。数据表示为平均值±SD；n=3。另请参见图S3。
图4
图4
ASS1系统在T细胞中被抑制（A）ATAC序列ASS1系统在所示培养基中培养72小时的THP1细胞中，显示来自−Arg细胞的ATF4 ChIP-seq以进行比较。底部：ATAC-seq记录道叠加在突出显示的区域ASS1系统，三个重复的平均值。（B） ATAC-seq网址：ASS1系统在受刺激的T细胞中，如（A）。（C） 刺激T细胞和在指定培养基中培养72小时的THP1细胞中H3K9me3、H3K27me3和H3K4me3的ChIP-qPCR数据表示为平均值±SEM；n=4。（D） 在完全培养基（+Arg）、含有20μM精氨酸、没有（低Arg）或（低Arg+2HG）添加500μM 2HG或缺乏精氨酸（−Arg）的培养基中培养72小时的受刺激T细胞中，对H3K9me3、H3K27me3和ATF4进行ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM；n=4。（E） ASS1和ATF4在所示培养基中培养72小时的受刺激T细胞中的代表性western blot。非特异性条带用星号表示。右：量化，根据GAPDH标准化，相对于+Arg。数据表示为平均值±SEM；n=5。∗∗p<0.01，∗∗∗∗p＜0.0001（Dunnett多重比较检验）。（F） 的模型ASS1系统精氨酸耗竭对T细胞和THP1细胞的调节。THP1单元内的可访问性ASS1系统允许ATF4在低和−Arg条件下结合，诱导ASS1系统表达式。在T细胞中，ATF4结合和ASS1系统表达受两个相互竞争的过程调节：ATF4在低或−Arg条件下激活，但ASS1系统启动子被抑制。在−Arg下，H3K9me3/H3K27me3升高ASS1系统阻止ATF4绑定。另请参见图S4。
图5
图5
ASS1系统上调是一种常见的肿瘤对精氨酸饥饿的反应（a）肿瘤细胞系在指定培养基中的生长。急性髓细胞白血病；急性早幼粒细胞白血病；急性淋巴细胞白血病。数据表示为平均值±SD；n=4。（B） qRT-PCR用于ASS1系统在指定的细胞系中，在+Arg和−Arg培养基中培养。数据标准化为GAPDH公司，相对于每个细胞系中的+Arg，表示为平均值±SD；n=4或6（HeLa）。∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001（Šidák的多重比较试验）。（C） 对照（NT）HeLa细胞或KD后ASS1和ATF4的代表性western blotASS1系统或ATF4型在指定的培养基中培养72小时（右）定量，相对于+Arg NT细胞归一化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM；n=3。∗p<0.05（Dunnett多重比较试验）。（D） 对照（NT）HeLa细胞的生长或随后的KDASS1系统或ATF4型，在指定的培养基中孵育。数据表示为平均值±SD；n=3。（E） ChIP-qPCR检测THP1和HeLa细胞在指定培养基中培养72小时后ATF4和CEBPβ水平。数据表示为平均值±SEM；n=3。（F） HeLa细胞中H3K9me3和H3K27me3在指定培养基中培养72小时后的ChIP-qPCR。数据表示为平均值±SEM；n=3。另请参见图S5。
图6
图6
精氨酸缺乏的T细胞显示ATF4/CEBPβ结合和染色质可及性降低（A）左：在ChIP-seq中识别出的ATF4和CEBPβ峰数量，这些峰来自于在指定培养基中培养72小时的受刺激T细胞和THP1细胞。右：在低精氨酸或−精氨酸条件下T细胞中识别的ATF4-ChIP-seq峰重叠。（B） 在所示培养基中孵育的T细胞和THP1细胞ATF4（左）和CEBPβ（右）的参考正常化ATIP-seq水平达到ATF4峰值（彩色线）。显示T细胞ATF4峰值的平均水平，该峰值仅在低精氨酸条件下、精氨酸饥饿条件下或在这两种条件下（常见）出现，如（A）所示。（C） 在+Arg和−Arg培养基中培养的受刺激T细胞之间的染色质可及性差异。红色和蓝色圆点表示在−Arg下ATAC峰值显著增加和减少；错误发现率（FDR）<0.05。（D） T细胞ATF4处的染色质可及性（ATAC-seq）达到峰值，如（B）所示。（E） 在所示培养基中孵育的T细胞ATAC峰值处的参考正常化ATF4和CEBPβChIP-seq水平。显示精氨酸存储T细胞中可及性降低（更封闭）、可及性增加（更开放）或无变化（未受影响）的峰值的平均水平，如（C）所示。（F） T细胞ATAC峰值的参考正常化H3K27me3 ChIP-seq水平，如（E）所示。（G） 参考标准化的H3K27me3在T细胞ATF4峰处的ChIP-seq水平，如（B）所示。另请参见图S6。
图7
图7
精氨酸饥饿破坏T细胞的染色质和代谢重编程（A）T细胞在指定培养基中刺激72小时后染色质的可及性差异。红色和蓝色圆点表示刺激后ATAC峰值显著增加和减少；FDR＜0.05。（B） K-表示在+Arg培养基（见A，左）中刺激后，使用来自未刺激T细胞（US）和在所示培养基中刺激72小时的T细胞的ATAC-seq，对不同的ATAC峰进行聚类（K=5）。每列为一个样本，每行有一个ATAC峰。（C） （B）中ATAC-seq数据的主成分分析。每个点代表一个样本；n=3。PC，主要部件。（D） 非刺激T细胞和T细胞中S6磷酸化（Ser235/Ser236）的代表性western blot，在+Arg、低Arg或−Arg培养基中刺激24小时，或在20 nM雷帕霉素（rapa）存在下刺激+Arg培养液。底部：量化，与GAPDH标准化，相对于未刺激T细胞。数据表示为平均值±SEM；n=4。∗∗p<0.01，∗∗∗∗p＜0.0001（Dunnett多重比较检验）。（E） 在指定的培养基中刺激T细胞的生长。数据表示为平均值±SD；n=5。（F） 未刺激T细胞（US）和在指定培养基中刺激72小时的T细胞代谢物水平的层次聚类分析。每列为一个样本，每行为一个代谢物。（G） （F）中代谢物数据的主成分分析。每个点代表一个样本；n=5。（H） 未刺激的T细胞和在指定培养基中刺激72小时的T细胞的海马分析。数据为四个供体的平均值±SEM。∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，∗∗∗∗p<0.0001，在所有时间点与+Arg进行比较（Tukey多重比较试验）。参见图S7和表S3。
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