TP53-Activated lncRNA GHRLOS Regulates Cell Proliferation, Invasion, and Apoptosis of Non-Small Cell Lung Cancer by Modulating the miR-346/APC Axis

doi:10.3389/fonc.2021.676202

.2021年4月21日：11:676202。

doi:10.3389/fonc.2021.676202。 eCollection 2021年。

TP53激活的lncRNA GHRLOS通过调节miR-346/APC轴调节非小细胞肺癌的细胞增殖、侵袭和凋亡

柯仁^1 2, 孙京辉¹, 刘玲玲^1 2, 杨玉平^三, 李红辉⁴, 王志超¹, 精铸灯¹, 侯敏（音）¹, 贾秋¹, 魏昭^1 5

附属公司

¹实验医学院/四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室，成都医学院，中国成都。
²四川省发展与再生重点实验室，成都医学院，中国成都。
^三成都医学院第一附属医院肺危重病内科，中国成都。
⁴成都爱尔眼科医院屈光外科，中国成都。
⁵香港城市大学生物医学系，中国香港。

PMID： 33968785
预防性维修识别码：项目管理委员会8097184
内政部： 10.3389/fonc.2021.676202

TP53激活的lncRNA GHRLOS通过调节miR-346/APC轴调节非小细胞肺癌的细胞增殖、侵袭和凋亡

柯仁等。前Oncol. 2021.

.2021年4月21日：11:676202。

doi:10.3389/fonc.2021.676202。 eCollection 2021年。

作者

柯仁^1 2, 孙京辉¹, 刘玲玲^1 2, 杨玉平^三, 李洪辉⁴, 王志超¹, 精铸灯¹, 侯敏（音）¹, 贾秋¹, 魏昭^1 5

附属公司

¹实验医学院/四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室，成都医学院，中国成都。
²四川省发展与再生重点实验室，成都医学院，中国成都。
^三成都医学院第一附属医院肺危重病内科，中国成都。
⁴成都爱尔眼科医院屈光外科，中国成都。
⁵香港城市大学生物医学系，中国香港。

PMID： 33968785
预防性维修识别码：项目管理委员会8097184
内政部： 10.3389/fonc.2021.676202

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）是世界范围内死亡率较高的肺癌的主要类型。为了改进非小细胞肺癌的治疗，探索非小细胞肝癌进展的分子机制并确定其潜在的治疗靶点非常重要。长非编码RNA（lncRNAs）在调节包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种肿瘤进展中发挥着重要作用。我们发现非小细胞肺癌细胞系和组织中lncRNA GHRLOS减少，这与非小细胞肝癌患者预后不良有关。然而，lncRNA GHRLOS在非小细胞肺癌进展中的作用和潜在机制尚不清楚。采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测lncRNA GHRLOS在NSCLC细胞系和NSCLC患者活检标本中的表达。GHRLOS对NSCLC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响由两种方法测定在体外和体内实验。通过双核糖核酸酶报告子分析和染色质免疫沉淀（ChIP）结合qRT-PCR分析确定GHRLOS与TP53之间的相互作用。进行RNA免疫沉淀（RIP）以验证GHRLOS与microRNA-346（miR-346）之间的结合。还进行了双荧光素酶报告分析，以揭示miR-346与腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）3'非翻译区（3'UTR）之间的相互作用mRNA。我们的数据表明，lncRNA GHRLOS的过度表达通过调节非小细胞肺癌细胞中CDK2、PCNA、E-cadherin、N-钙粘蛋白、Bax和Bcl-2的表达，抑制了癌细胞的增殖和侵袭，并促进了细胞凋亡。此外，lncRNA GHRLOS通过TP53与GHRLOS公司发起人。lncRNA GHRLOS的结合靶点为miR-346。令人印象深刻的是，miR-346的过度表达促进了细胞增殖和侵袭，并抑制了细胞凋亡，然而，这些作用可以被lncRNA GHRLOS的过度表达所阻断在体外和体内总之，本研究揭示了由TP53上调的lncRNA GHRLOS作为miR-346的分子海绵，协同调节miR-345靶点APC的表达，并可能抑制NSCLC的进展通过TP53/lncRNA GHRLOS/miR-346/APC轴，代表了一种新的途径，可用于针对非小细胞肺癌的靶向治疗。

关键词：APC；非小细胞肺癌；TP53；lncRNA GHRLOS；miR-346。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
LncRNA GHRLOS在肺肿瘤组织中的表达降低，具有临床意义。**（A）**临床肺组织样本的H&E染色，包括肿瘤组织和非肿瘤组织（邻近组织）。**（B）**肺组织lncRNA GHRLOS表达的qRT-PCR分析&第页<0.01与。非肿瘤。**（C）**人正常肺上皮细胞系（BEAS-2B）和非小细胞肺癌细胞系lncRNA GHRLOS表达的qRT-PCR分析&第页<0.01与。BEAS-2B。**（D）**基于lncRNA GHRLOS表达的非小细胞肺癌患者总生存率的Kaplan-Meier分析。

图2
LncRNA GHRLOS抑制非小细胞肺癌细胞的生长和侵袭，并增加凋亡。**（A）**慢病毒诱导A549和NCI-H460细胞48小时lncRNA GHRLOS过度表达的qRT-PCR测定，p<0.01与。Lv-vector公司。**（B）**CCK-8检测lncRNA GHRLOS在指定时间点对慢病毒感染后癌细胞增殖的影响，p<0.01与。Lv-vector公司。**（C、D）**培养14天后，lncRNA GHRLOS对癌细胞生长影响的集落形成试验，p<0.01与。Lv-vector公司。**（E）**lncRNA GHRLOS过表达48 h后A549和NCI-H460细胞中细胞生长相关基因PCNA和CDK2表达的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv-vector公司。**（F、G）**lncRNA GHRLOS对癌细胞侵袭作用的跨维分析，&p<0.01与。Lv-vector公司。**（H）**感染48 h后A549和NCI-H460细胞粘附相关基因包括E-cadherin和N-cadherin的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv-vector公司。**（I，J）**Annexin V-FITC/PI分析lncRNA GHRLOS对癌细胞凋亡的影响，&p<0.01与。Lv-vector公司。**（K）**慢病毒感染NSCLC细胞48 h后细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的qRT-PCR分析与。Lv-vector公司。

图3
TP53激活了非小细胞肺癌细胞中lncRNA GHRLOS的转录。**（A）**基于使用JASPAR的分析预测的人lncRNA GHRLOS启动子中TP53的结合基序。**（B、C）**TP53在NSCLC细胞中敲低或过度表达48小时后TP53表达的qRT-PCR分析，&p<0.01与。Lv-sh-NC或Lv-vector。**（D、E）**TP53敲低或过表达48小时后非小细胞肺癌细胞lncRNA GHRLOS表达的qRT-PCR分析与。Lv-sh-NC或Lv-vector。**（F、G）**ChIP分析评估了TP53结合位点，&p<0.01与。抗IgG抗体。**（H）**荧光素酶报告物分析用质粒示意图。**（I，J）**双荧光素酶报告分析检测了荧光素酶活性，&p<0.01与。Lv-vector公司。**（K）**对感染指示慢病毒48小时后14天培养的癌细胞的生长进行集落形成分析，p<0.01与。Lv-vector，Фp<0.01与。TP53级。**（左）**Transwell检测感染48小时后癌细胞的侵袭性，p<0.01与。Lv-vector，Фp<0.01与。TP53级。**（百万）**Annexin V-FITC/PI对感染48 h后癌细胞凋亡的分析，&p<0.01与。Lv-vector，Фp<0.01与。TP53级。

图4
LncRNA GHRLOS是miR-346的分子海绵。**（A）**lncRNA GHRLOS亚细胞定位的qRT-PCR分析。GAPDH用作细胞质内对照，U6用作细胞核内对照。**（B）**临床非小细胞肺癌组织中miR-346的qRT-PCR分析，p<0.01与。非肿瘤。**（C）**获得了lncRNA GHRLOS与miR-346之间的预测结合位点。**（D）**抗Ago2介导的RIP检测后A549和NCI-H460细胞lncRNA GHRLOS和miR-346表达的qRT-PCR分析，p<0.01与。输入。**（E）**双荧光素酶报告法检测感染Mock、miR-346模拟物或miR-345抑制剂48小时后lncRNA GHRLOS与miR-348之间的相互作用，p<0.01与。吕莫克。**（F）**A549和NCI-H460细胞指示感染48小时后miR-346的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv矢量。

图5
lncRNA GHRLOS和miR-346在癌细胞增殖、侵袭和凋亡中的相互作用。**（A）**集落形成实验显示lncRNA GHRLOS和miR-346对培养14天后转染的癌细胞的生长具有相互抑制作用，p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（B）**慢病毒感染癌细胞侵袭性的跨well分析，&p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（C）**qRT-PCR对指示慢病毒感染48 h后A549和NCI-H460细胞中细胞生长生物标志物PCNA和CDK2表达的影响，p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（D）**qRT-PCR对A549和NCI-H460细胞中细胞粘附生物标记物（包括E-cadherin和N-cadherin）的表达的影响，p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（E）**慢病毒感染48 h后癌细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的qRT-PCR分析与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（F）**裸鼠接种28天后的肿瘤照片。**（G）**各组（n=6）在接种NCI-H460细胞后的指定时间点测量肿瘤体积。**（H）**接种28天后裸鼠肿瘤重量，&p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（一）**异种移植瘤中PCNA、CDK2、E-cadherin、N-cadherin，Bcl-2和Bax表达的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。

图6
APC是miR-346的靶点，受lncRNA GHRLOS和miR-345的相互作用调节。**（A）**预测APC 3'UTR中miR-346的结合位点（STARBASE数据库）。**（B）**非小细胞肺癌组织APC表达的qRT-PCR分析与。非肿瘤。**（C）**APC 3'UTR荧光素酶活性的双荧光素素酶报告分析，&p<0.01与。Lv-Mock+Lv-vector，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（D）**慢病毒感染癌细胞48小时APC表达的qRT-PCR分析与。Lv模型+Lv矢量，#p<0.01与。Lv-miR-346+Lv-GHRLOS。**（E）**慢病毒感染48h后癌细胞APC表达的Western blot分析。

图7
沉默APC可阻断细胞增殖、侵袭和凋亡生物标记物上miR-346敲除或lncRNA GHRLOS过度表达控制的基因表达。**（A、B）**慢病毒感染A549和NCI-H460细胞48小时后基因表达的qRT-PCR分析&第页<0.01与。Lv-Mock+Lv-sh-NC#第页<0.01与。Lv-miR-346+Lv-sh-APC。**（C、D）**慢病毒感染NSCLC细胞48小时基因表达的qRT-PCR分析&第页<0.01与。Lv-Mock+Lv-sh-NC#第页<0.01与。Lv-miR-346+Lv-sh-APC。

图8
APC表达受到过表达或TP53表达干扰的调节。**（A）**TP53过度表达或敲低48小时后TP53表达的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv-vector公司。**（B）**慢病毒感染A549和NCI-H460细胞48小时后APC、lncRNA GHRLOS和miR-346表达的qRT-PCR分析，p<0.01与。Lv-vector公司。**（C）**显示感染的A549和NCI-H460细胞APC表达的Western blot分析。**（D）**lncRNA GHRLOS介导非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的分子机制示意图。

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