Repurposing the FDA-approved anticancer agent ponatinib as a fluconazole potentiator by suppression of multidrug efflux and Pma1 expression in a broad spectrum of yeast species

doi:10.1111/1751-7915.13814

.2022年2月；15(2):482-498.

doi:10.1111/1751-7915.13814。 Epub 2021年5月6日。

通过抑制多种酵母菌中的多药外排和Pma1表达，将FDA批准的抗癌药物波纳替尼重新用作氟康唑增强剂

林刘（Lin Liu）¹, 通江^2 3, 贾州¹, 伊坤梅¹, 李金阳¹, 谭景聪¹, 陆启伟¹, 李景泉¹, 彭一冰^4 5, 陈昌斌^2 6, 刘宁宁¹, Hui Wang（王慧）¹

附属机构

¹上海交通大学医学院公共卫生学院肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，上海，200025，中国。
²中国科学院上海巴斯德研究所分子病毒学与免疫学重点实验室微生物发展与健康中心，上海，200031。
³中国科学院大学，北京，中国。
⁴中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院瑞金医院检验科，邮编：200025。
⁵中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院医学检验学院，邮编：200025。
⁶中国科学院上海巴斯德研究所南京独角兽创新研究院，南京，211135，中国。

PMID： 33955652
预防性维修识别码：项目管理委员会8867973
内政部： 10.1111/1751-7915.13814

通过抑制多种酵母中的多药流出和Pma1表达，将美国食品药品监督管理局批准的抗癌剂波纳替尼重新用作氟康唑增效剂

林刘（Lin Liu）等。 Microb生物技术. 2022年2月.

.2022年2月；15(2):482-498.

doi:10.1111/1751-7915.13814。 Epub 2021年5月6日。

作者

林刘（Lin Liu）¹, 通江^2 3, 贾州¹, 伊坤梅¹, 李金阳¹, 谭景聪¹, 陆启伟¹, 李景泉¹, 彭一冰^4 5, 陈昌斌^2 6, 刘宁宁¹, Hui Wang（王慧）¹

附属机构

¹上海交通大学医学院公共卫生学院肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，上海，200025，中国。
²中国科学院上海巴斯德研究所分子病毒学与免疫学重点实验室微生物发展与健康中心，上海，200031。
³中国科学院大学，北京，中国。
⁴中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院瑞金医院检验科，邮编：200025。
⁵中国上海市瑞金二路197号上海交通大学医学院医学检验学院，邮编：200025。
⁶中国科学院上海巴斯德研究所南京独角兽创新研究院，南京，211135，中国。

PMID： 33955652
预防性维修识别码：项目管理委员会8867973
内政部： 10.1111/1751-7915.13814

摘要

由于真菌感染的发病率和死亡率每年都在上升，真菌感染已成为全球对人类健康的主要威胁。耐药性的出现和抗真菌药物的有限库存进一步加剧了目前的形势，导致医学真菌学面临越来越大的挑战。在这里，我们发现，FDA批准的抗肿瘤药物波纳替尼显著增强了最广泛使用的抗真菌药物唑-氟康唑的活性。对波纳替尼的进一步详细研究表明，其与氟康唑的结合显示出广谱协同作用，可对抗多种人类真菌病原体，如白色念珠菌、酿酒酵母和新生隐球菌。对作用模式的机制研究表明，阿法替尼减少了氟康唑通过Pdr5的流出，并抑制了质子泵Pma1的表达。综上所述，我们的研究确定波纳替尼是一种新的抗真菌药物，可以增强氟康唑对多种真菌病原体的药物活性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
波纳替尼和氟康唑联合使用可协同抑制*白色念珠菌*,*酿酒酵母*和*C.新生代*.白色念珠菌（SC5314）（A–D），*酿酒酵母*（BY4742）（E–H）和*C.新生代*（H99）（I–L）分离株在YPD培养基中接受氟康唑、波纳替尼或两者的两倍连续稀释。外径₆₀₀每15次测量一次 30°C下的最小值，并使用CLSI肉汤微量稀释法（M38‐A）的参考指南计算FICI。

图2
波那提尼将氟康唑从抑菌剂转化为杀菌剂，并抑制菌丝形成。答：。*白色念珠菌*将（SC5314）细胞接种到添加或不添加指示化合物（DMSO，32‐128）的YPD液体培养基中 μg/ml氟康唑，32‐128 μM波纳替尼或两者）。在指定的时间段（0、24和48）孵育后，对SC5314的存活集落形成单位（CFU）进行计数 h） ●●●●。B。*白色念珠菌*（SC5314）细胞在三种不同的菌丝诱导培养基（M199缓冲至pH8，50 mM MOPS；蜘蛛；含有二甲基亚砜、氟康唑（2 微克毫升^‐1)，波那替尼（5 μM）或组合。细胞在37°C下培养，4天后在光学显微镜下检查菌丝形态培养h。

图3
波那提尼与氟康唑协同作用，对抗唑类耐药临床菌株，并防止出现耐药性。CCC49（A–D）和CCC80（E–H）在YPD培养基中接受氟康唑、波纳替尼或两者的双重连续稀释。外径₆₀₀每15次测量一次在30°C下持续16分钟 h、 FICI采用标准CLSI肉汤微量稀释法（M38‐A）计算。一、。*白色念珠菌*将（SC5314）细胞接种到含有指定剂量化合物（DMSO，32 微克毫升^‐1氟康唑，32 μM波纳替尼，组合）。3天后观察抗性菌株的细胞生长天*****P（P）* < 0.0001与DMSO（单向方差分析和Tukey多重比较）。

图4
波那提尼通过Pdr5增强氟康唑的细胞内超积累。A–C。这个*酿酒酵母*WT和16个ABC突变株分别用指定浓度的波那提尼或氟康唑处理。D–E类。用白僵菌素、波纳替尼或氟康唑对BY4742进行预处理，然后添加相同浓度的罗丹明-6G。荧光显微镜下观察到罗丹明-6G的细胞内积累。

图5
通过全基因组测序鉴定波纳替尼靶点。A–B类。用波那替尼处理菌株RY0566（野生型）和2336（缺乏所有16个外排泵编码基因的16ABC突变株）。C–D。用波纳替尼处理菌株2336和波纳替尼耐药突变体。E.PCR产物的凝胶电泳结果。从耐药突变细胞中提取DNA并通过PCR扩增。（F） PCR产物的测序结果。抗性突变体的全基因组测序确定的突变显示为氨基酸变化。所有耐药突变体在Pma1中都有相同的突变。G.从用波那替尼处理的ABC16突变株2336中提取总RNA，并准备用于qRT-PCR。误差条表示三个生物三倍体的标准偏差。H.蛋白质提取物是从经波那替尼处理的ABC16突变细胞中制备的，并分别使用抗Pma1和微管蛋白的抗体进行西方分析。使用图像J对斑点进行量化。Tubulin用作负荷控制**P（P）* < 0.05; ****P（P）* < 0.001或*****P（P）* < 0.0001（单向方差分析和Tukey多重比较）。

图6
通过Pdr5抑制氟康唑流出和抑制Pma1表达，波纳替尼在增强氟康唑抗真菌功效中的作用的模型描述。波那提尼（PubChem CID:24826799)通过与Pdr5结合促进细胞内氟康唑（PubChem CID:3365）积累。另一方面，波那替尼通过抑制位于质膜上的质子泵Pma1，扰乱了细胞溶质的pH稳态。最终，波纳替尼通过这两条途径的双重作用导致细胞死亡。

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1. Basso，V.、Tran，D.Q.、Ouellette，A.J.和Selsted，M.E.（2020）宿主防御肽作为抗真菌药物开发的模板。真菌杂志6:241。-项目管理咨询公司-公共医学
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