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.2021年4月；592(7856):799-803.
doi:10.1038/s41586-021-03422-5。 Epub 2021年4月14日。

AMBRA1调节细胞周期蛋白D以保护S期进入和基因组完整性

埃米利亚诺·马亚尼 # 1 2, 贾科莫·米莱蒂 # 三 4, 弗朗西丝卡·纳齐奥 三, 瑟斯·格罗恩布·霍尔德加德 1, 吉里娜·巴特科娃 5 6, 萨尔瓦多里扎 7, 瓦伦蒂娜·契安法内利 1 三, 马·洛伦特 8 9, 丹尼尔·西蒙涅西 10 11 12, 米里亚姆·迪马尔科 2, 帕斯奎尔·达库恩佐 13 14, 卢卡·迪·利奥 15, 里克·拉斯穆森 16, 科斯坦扎·蒙塔格纳 7 17 18, 玛丽莲娜·拉西蒂 1, 克里斯蒂亚诺·德·斯特凡尼斯 19, Estibaliz Gabicagogeascoa公司 8 9, 格格利·罗纳 10 11 12, 内利达·萨尔瓦多 8 9, 伊曼纽拉·普波 20, 乔安娜·玛丽亚·默楚特·马亚 5 21, 科林·J·丹尼尔 22, 玛丽安娜·卡兰西 三 23, 缬草 三 24, 阿尔菲·奥沙利文 10 11 12, Yeon-Tae-Jeong先生 10 11 12, 马泰奥·博迪 三 4, 弗朗西斯科·罗素 25, 西尔维娅·坎佩洛 4, 安吉拉·加洛 三, 朱塞佩·菲洛梅尼 7, 莱蒂齐娅·兰泽蒂 20 26, 罗莎莉·西尔斯 22 27, 佩特拉·哈默利克 16 28, 阿曼多·巴托拉齐 29, 罗伯特·海因斯 30 31, 大卫·R·皮尔斯 30, 查尔斯·斯旺顿 30 31, 米歇尔·帕加诺 10 11 12, 吉列尔莫·贝拉斯科 8 9, 埃琳娜·帕帕里奥 2 32, 丹妮拉·德齐奥 15, 阿波利娜·玛亚·门多萨 5 21, 弗兰科·洛卡特利 三 33, 吉里·巴托克 34 35, 弗朗西斯科·塞科尼 36 37 38
附属公司

AMBRA1调节细胞周期蛋白D以保护S期进入和基因组完整性

埃米利亚诺·马亚尼等。 自然. 2021年4月.

摘要

哺乳动物的发育、成年组织的体内平衡以及避免包括癌症在内的严重疾病都需要一个合理的细胞周期以及无错误的基因组维护。复制基因组的关键细胞-脂肪决定由两条平行作用的主要信号通路控制——MYC通路和细胞周期蛋白D依赖性激酶（CDK）-视网膜母细胞瘤蛋白（RB）通路1,2MYC和细胞周期蛋白D-CDK-RB轴在癌症中通常被解除调控，这与基因组不稳定性增加有关。自噬性肿瘤抑制蛋白AMBRA1与细胞增殖的控制有关，但其潜在的分子机制尚不清楚。在这里，我们表明AMBRA1是从G1阶段向S阶段过渡的上游主调节器，因此可以防止复制压力。通过结合细胞和分子方法以及体内模型，我们发现AMBRA1通过调节D型细胞周期蛋白的降解来调节其丰度。此外，通过控制从G1期到S期的过渡，AMBRA1有助于在DNA复制期间保持基因组完整性，从而抵消发育异常和肿瘤生长。最后，我们确定CHK1激酶是AMBRA1缺陷肿瘤的潜在治疗靶点。这些结果促进了我们对复制期进入控制和基因组完整性的理解，并确定AMBRA1-cyclin D通路是一种关键的细胞周期调节机制，与胚胎发育和肿瘤发生中的基因组稳定性密切相关。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益M.P.是Coho Therapeutics、CullGen、Kymera Therapeotics和SEED Therapeunics的顾问，拥有财务利益。M.P.是Coho Therapeutics的联合创始人，是CullGen和Kymera Therapeotics科学咨询委员会的成员，也是Santi Therapeunics的顾问。其他作者声明没有相互竞争的利益。

数字

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扩展数据图1|。AMBRA1调节神经干细胞中细胞周期蛋白D的稳定性。
一，制作条件敲除小鼠模型的示意图。b条,c（c）、野生型和安布拉1cKO P21小鼠(b条)和大脑(c（c）).c（c），底部，PCR扩增的代表性图像Tm1c型,安布拉1和Cre公司.d日、野生型和安布拉1E18.5胚胎矢状切面中的cKO嗅球，Ki67抗体和Hoechst染色(n个= 3).电子，Ki67的量化+野生型和安布拉1cKO E13.5胚胎（图1b所示的矢状截面）(n个= 5).P（P）双尾未配对值t吨-测试。（f），小鼠胚胎内侧神经节隆起（MGE）神经干细胞提取和细胞培养的代表性方案。LGE，外侧神经节隆起。克、野生型和安布拉1cKO NSC如图1c所示(n个= 4).P（P）值采用双侧单因素方差分析，然后进行Sidak多重比较测试。小时左，从小鼠胚胎内侧神经节隆起提取的神经干细胞的代表性图像。右，野生型克隆神经球直径小提琴图安布拉1cKO国家安全委员会(n个= 3; 每种情况下共分析128个神经球）。P（P）双尾未配对值t吨-测试。我E13.5野生型和安布拉1cKO cyclin D1染色在DAPI上标准化，如图1e所示。P（P）双尾未配对值t吨-测试(n个= 5).j个、野生型和安布罗1E18.5胚胎矢状切面的cKO嗅球，细胞周期蛋白D1抗体和Hoechst染色(n个=3）。k个、野生型和安布拉1cKO E13.5胚胎，细胞周期蛋白D2染色(n个= 3).我，左，野生型和安布拉1cKO E13.5胚胎，RB染色（pS807/811）(n个= 5). 右侧，E13.5野生型和安布拉1cKO胚胎(n个= 5).P（P）双尾未配对值t吨-测试。米，左侧，野生型和野生型嗅球矢状切面中RB（pS807/811）的代表性图像安布拉1cKO E18.5胚胎。右，RB（pS807/811）阳性细胞数量的量化(n个= 3).P（P）双尾未配对值t吨-测试。n个、放线菌酮处理后野生型和安布拉1cKO国家安全委员会(n个= 3).o（o）、神经干细胞的逆转录定量PCR（qRT-PCR）；被调查的基因位于图表的底部(n个= 5).P（P）双尾未配对值t吨-测试。第页、对照的免疫印迹和AMBRA1型沉默SH-SY5Y细胞(n个= 3).q个，SH-SY5Y细胞AMBRA1免疫沉淀的免疫印迹。第页、沉默指定基因的SH-SY5Y细胞中AMBRA1、PP2AC和N-MYC的免疫印迹(n个=3）。除非另有说明，n个指的是生物独立的样品。对于免疫印迹，使用肌动蛋白作为负载对照。数据为平均值±标准偏差，标尺为250μm。
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扩展数据图2|。安布拉1缺乏影响细胞周期、细胞死亡和神经元分化。
一，环己酰亚胺时间进程中细胞周期蛋白D1和D2蛋白水平的密度定量，通过肌动蛋白进行标准化(n个= 3).P（P）值采用双侧单因素方差分析，然后进行Sidak多重比较测试。b条、野生型免疫印迹或安布拉1用环己酰亚胺和/或MG132处理cKO NSC指定时间。(n个= 3).c（c），诺卡唑治疗释放后神经干细胞中细胞周期相的分布(n个= 3).P（P）值采用双侧单因素方差分析，然后进行Sidak多重比较测试。d日、6小时BrdU并入passage-2野生型和安布拉1cKO NSCs，有或没有阿贝马西利治疗(n个= 3).P（P）值采用双侧单向方差分析，然后进行Tukey多重比较测试。电子、野生型和安布拉1cKO国家安全委员会(n个= 3). EA，早期凋亡；LA，晚期凋亡。P（P）值采用双侧单因素方差分析，然后进行Sidak多重比较测试。（f）左，阿贝马西利治疗后NSC中指示蛋白的免疫印迹。对，所示蛋白质的密度测定定量(n个= 3).P（P）通过双侧单因素方差分析和Sidak多重比较检验得出的值。克，左侧，野生型和安布罗1cKO E13.5胚胎，SOX2和TBR2染色。右，免疫染色阳性区域（SOX，n个= 6; TBR2，待定，n个= 4).P（P）双尾未配对值t吨-测试。小时左，野生型和安布拉1cKO E18.5胚胎，TBR2染色。对，免疫染色阳性区域的量化(n个= 6).P（P）双尾未配对值t吨-测试。箭头表示TBR2+室下区的细胞。我,j个、野生型和安布拉1cKO E18.5胚胎，神经元标记物NeuN染色。我左，中脑翼板放大倍率较高。对，免疫染色阳性细胞的定量(n个= 3).P（P）双尾未配对值t吨-测试。j个，更低的放大倍数，以更好地欣赏未裁剪的量化区域(n个= 3). 比例尺，500μm。除非另有说明，n个指生物独立样本。对于免疫印迹，肌动蛋白被用作负荷控制。数据为平均值±标准误差。除非另有说明，比例尺代表250μm。
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扩展数据图3|。AMBRA1–cyclin D1轴影响细胞周期。
一、对照的免疫印迹或AMBRA1型-沉默U87-MG细胞中的指示蛋白(n个= 3).b条，对照中细胞周期蛋白D1的免疫印迹或琥珀色1-用环己酰亚胺和/或MG132处理指定时间的沉默U87-MG细胞(n个= 3).c（c），对U87-MG细胞中的细胞周期蛋白D免疫印迹进行密度测定分析，所示基因沉默，如图1g所示(n个= 4).P（P）值采用单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试。d日左，U87-MG细胞中cyclin D1的免疫印迹沉默AMBRA1型表达和过度表达空载体（pcDNA）、野生型AMBRA1或AMBRA1（ΔWD40）。对，密度测定分析(n个= 3).P（P）值采用单向方差分析，然后进行Tukey多重比较测试。电子、免疫印迹分析对照组和对照组蛋白质提取物中的细胞周期蛋白D1免疫沉淀AMBRA1型-沉默的U87-MG细胞(n个= 3).（f），在U87-MG细胞中暂时过度表达空载体cyclin D1–Flag或cyclin D2（T286A）–Flag.的AMBRA1共免疫沉淀。细胞在裂解前用MG132处理3小时(n个= 3).克、折叠控件中单元格数量的更改或AMBRA1型-沉默的U87-MG细胞(n个= 11).P（P）双尾未配对值t吨-测试。小时、未经处理或用MLN4924处理4 h的U87MG、BJ-hTERT和U2OS细胞的指示蛋白的免疫印迹(n个= 3).我,j个细胞经cyclin D1、EdU抗体免疫染色，Hoechst复染。我，散点图，报告EdU与Hoechst的单细胞总核强度（通过三个独立实验检测的细胞：si可控硅,n个= 3,279; 硅AMBRA1型,n个=3608个单元格）。j个，表示细胞周期蛋白D1总核强度（si可控硅,n个= 3,279; 硅AMBRA1型,n个=3608个单元格。中位数si可控硅=169654；硅琥珀色1=429623）。k个,我、对照组和对照组细胞周期标记物的免疫印迹AMBRA1型-沉默的BJ-hTERT细胞(k个)和细胞周期分类的U2OS-FUCCI细胞(我)(n个= 3).米，指示蛋白质的免疫印迹AMBRA1型-通过24小时血清饥饿同步沉默的BJ-hTERT细胞。在指示的饥饿恢复时间点后收集细胞(n个= 3).n个、控制和AMBRA1型-将U2OS-FUCCI细胞沉默0至14小时，不同图像之间间隔2小时。G1相的长度如图1k所示(n个= 3). 比例尺，5μm。o（o），控制细胞增殖或AMBRA1型-沉默的BJ-hTERT细胞（24小时和48小时n个= 6; 72小时硅可控硅n=6，siAMBRA1 n型= 5).第页,q个、控制或AMBRA1型-沉默的U2OS-FUCCI细胞。第页，代表性等高线图。q个，S–G2期细胞增加倍AMBRA1型-相对于对照细胞下调的细胞(n个= 10).第页，方框图（中线、中位数；方框极限，第25和75百分位；胡须，最小值和最大值），显示si的细胞周期长度可控硅(n个= 65; 中位数=13）或si琥珀色1(n个=65；中位数=8.5）通过三个独立实验检测U2OS-FUCCI细胞。除非另有说明，n个指生物独立样本；数据为平均值±标准偏差。使用双尾非配对分析数据t吨-测试(克,o（o）,q个)或双尾Mann-Whitney检验(j个,第页). 对于免疫印迹，使用肌动蛋白或β-微管蛋白作为负荷控制。
扩展数据图4|
扩展数据图4|。AMBRA1缺乏导致复制应激。
一BJ-hTERT细胞不同细胞周期阶段的γH2AX总核强度(n个= 3). 数据为平均值±标准差。b条，对照组γH2AX病灶的平均数量或AMBRA1型-沉默的U2OS细胞(n个= 3).c（c）、对照的碱性彗星试验，AMBRA1型-和自动液位计7-沉默的U2OS细胞(n个= 3).d日，散点图显示对照组免疫染色的γH2AX与Hoechst总核强度，AMBRA1型-和自动液位计7-沉默的BJ-hTERT细胞。γH2AX阳性细胞的比例（红色，任意截止）显示为（si可控硅,n个= 721; 硅AMBRA1型,n个= 725; 硅自动液位计7,n个=在3个独立实验中检测了733个细胞）。电子，对照组γH2AX的免疫印迹，AMBRA1型-和自动液位计7-沉默的BJ-hTERT细胞(n个= 3).（f），控制中的同源重组（HR）效率，AMBRA1型-和自动液位计7-沉默的U2OS细胞(n个=3）。数据为平均值±标准差。克，对照组和对照组中每个细胞核的BRCA1病灶数琥珀色1-未经处理或经3-Gy照射处理的沉默U2OS细胞，经BRCA1染色(n个=在3个独立实验中检测了500个细胞，中心表示平均值）。小时，控制有丝分裂时间(n个=在3个独立实验中检测的91个细胞）或AMBRA1型-沉默(n个=在3个独立实验中检测的72个细胞）。条形图表示中位数和四分位数范围。我，通过延时成像评估有丝分裂退出时的死亡细胞(n个=2个独立实验；每种情况下超过60个细胞）。j个，53BP1核病灶在G1 U2OS细胞中的分布(n个= 3).k个、对照组γH2AX总量与Hoechst强度AMBRA1型-未经处理或用2 mM羟基脲（HU）处理2 h（si可控硅,n个= 2,481; 硅AMBRA1型,n个= 2,237; 硅可控硅+胡，n个= 2,484; 硅AMBRA1型+胡，n个=2281个细胞；散点图代表了n个=3个独立实验）。我，CHK1标准化蛋白水平的量化如图2e所示(n个= 3).米,n个，BJ-hTERT细胞，如扩展数据图4k所示，用放线菌酮或放线菌胺和2 mM羟基脲处理。米，对总细胞裂解物中的指示蛋白质进行免疫印迹分析。n个，量化标准化CHK1蛋白表达水平(n个= 4).o（o）,第页、qRT-PCR分析对照或AMBRA1型-BJ-hTERT静音(o（o）)和U2OS(第页)细胞，分别(CCNA2型,E2F1系列和RAD51 n型= 5;巴西航空公司= 4;CHEK1 n（检查1 n）= 3).q个,第页、对照组中指示蛋白质的免疫印迹分析或AMBRA1型-静音U2OS(q个)和BJ-hTERT(第页)单元格(n个=3）。秒，基因本体（GO）生物过程（2018），来源于RNA测序（RNA-seq）实验中DEA（差异表达分析）基因的富集分析。来自三个RNA-seq独立实验的DEA被用作网络软件EnrichR的输入,.P（P）使用Fisher精确检验计算的值；更清晰的条显示较小的P（P）值。除非另有说明，n个指生物独立样本；数据为平均值±标准偏差。使用双尾非配对分析数据t吨-测试(一,b条,c（c）,（f）,j个,我,n个,o（o）,第页)或双尾Mann-Whitney检验(克,小时). 对于免疫印迹，使用β-微管蛋白、SOD1或GADPH作为负荷对照。
扩展数据图5|
扩展数据图5|。AMBRA1缺乏导致复制应激。
一，DEA基因分析（来自n个=3个独立的RNA-seq实验）预测AMBRA1耗尽后激活的转录因子。b条、qRT-PCR分析对照或AMBRA1型-针对不同细胞周期阶段分类的沉默U2OS-FUCCI细胞(n个= 3)c（c），U2OS细胞中指示蛋白的免疫印迹干扰了指示的自噬调节因子(n个= 3).d日，左，控制和AMBRA1型-未经处理或用0.1μM阿贝霉素处理48小时的沉默BJ-hTERT细胞。右，单细胞γH2AX核平均强度与Hoechst的代表性散点图，以及对照组和对照组的细胞周期相位门控策略AMBRA1型阿贝马昔单抗处理的沉默BJ hTERT细胞(n个=643个细胞）。电子，对照U87-MG细胞或具有可诱导的细胞周期蛋白D1表达的U87-MG细胞在用dox刺激后三天的细胞计数(n个= 3).（f），在用dox刺激后的指定时间点，具有可诱导cyclin D1表达的对照BJ-hTERT细胞或BJ-htER细胞的细胞计数，在非诱导细胞（1-d V15+，n个= 6; 三维V15+、三维E30+、，n个= 4; 1-d E30+、4-d V15+、4-dE30+，6-dV15+和6-dE30＋，n个= 5). V15+：dox处理的对照细胞；E30+：dox处理的细胞周期蛋白D1诱导细胞。克,小时，U87-MG中每个细胞周期阶段的细胞百分比(克)和BJ-hTERT(小时)未经治疗或强力霉素刺激48小时后，对照细胞或具有诱导性细胞周期蛋白D1表达的细胞(n个= 3).我，在有或无dox刺激的指示时间点，对对照U87-MG细胞或具有可诱导cyclin D1表达的U87-MG-细胞中的指示蛋白进行免疫印迹(n个= 3).j个,k个，平均拨叉速度(j个)（最小kb−1)和叉对称性分析(k个)来自对照BJ-hTERT细胞和具有可诱导cyclin D1表达的BJ-htER细胞的DNA纤维，如图2d所示处理（计分叉：−dox，n个= 312; 三维dox，n个= 449; 4-d道克斯，n个= 429; 6-d道克斯，n个= 426). 数据为平均值±标准差。我，图2g中免疫组织化学染色定量(n个=3只小鼠）。米、野生型或安布拉1cKO国家安全委员会(n个= 3). 除非另有说明，n个指生物独立样本；数据为平均值±标准偏差。使用双尾非配对分析数据t吨-测试(b条,我)，双尾Mann-Whitney检验(d日,j个,k个)，双向方差分析后进行Sidak多重比较检验(电子,克,小时)或单因素方差分析后进行Sidak多重比较检验(（f）). 精确P（P）补充方法的“统计分析和数据再现性”部分提供了数值。
扩展数据图6|
扩展数据图6|。生物信息学分析AMBRA1型癌症患者。
一，TCGA数据库中表达数据的生物信息学分析。饼图显示AMBRA1型-与所示数据集中的总量（灰色）相比，低癌症（浅蓝色）。膀胱尿路上皮癌；COAD，结肠腺癌；肾肾透明细胞癌；肾乳头状细胞癌；肺鳞状细胞癌；前列腺癌；子宫体子宫内膜癌。b条，Xena相关性分析AMBRA1型mRNA表达和干细胞评分。图中阴影区域表示置信区间（95%）。c（c），棒状图显示了AMBRA1型TCGA泛癌图谱研究数据集中注释的突变。d日，频率AMBRA1型TCGA泛癌地图集研究数据集中的突变（以百分比表示）。截止线选择为2%。电子，的OncoprintAMBRA1型改变（同源缺失、浅缺失、突变），以及TP53型和表皮生长因子受体TCGA Pan-Lung癌症数据集的突变。（f）TCGA Pan-Lung癌症数据集中指示基因的互斥性和共现性分析。P（P）由单侧Fisher精确测试得出的值。克，对泛癌地图集研究数据库中患者的Kaplan–Meier分析基于AMBRA1型（低，低于20%；高，高于80%）。图从GEPIA在线数据库下载(http://gepia2.cancer-pku.cn/分析).P（P）源自单侧对数秩Mantel–Cox检验的值）。小时，基于RNA-seq分析的Kaplan–Meier总生存率分析琥珀色1使用KM-plotter肺腺癌数据库的mRNA水平。
扩展数据图7|
扩展数据图7|。AMBRA1控制肺癌小鼠模型中的肿瘤生长。
一，鼠标模型示意图和系统初始测试。这个喀斯特G12D系列转基因小鼠与条件基因交配安布拉1flox/flox公司鼠标生成安布拉1+/+：：克拉斯G12D系列/+和安布拉1flox/flox公司：：克拉斯G12D系列/+基因型。肺癌特异性表达喀斯特G12D系列和删除安布拉1通过鼻内接种携带Cre重组酶的缺陷腺病毒颗粒诱导。b条，AMBRA1免疫沉淀的免疫印迹分析安布拉1flox/flox公司：：克拉斯G12D系列/+给药AdenoCre 16周后的小鼠(n个= 3).c（c），表达式安布拉1Cre给药后的漂浮等位基因通过RT-PCR在肺组织样本中进行验证，如c（c）(n个= 3). 引物被设计用来区分野生型和漂浮型等位基因。d日，固定肺的H&E图像的代表性示例。底部，支气管放大图，突出肿瘤起始部位。比例尺，1 mm。电子，图3b中免疫组织化学染色定量（Ki67，n个= 3; γH2AX，n个=3；RPA（pS4/8），n个=3；细胞周期蛋白D1，n个= 4; c-Myc（pS62），n个=每种情况下两个独立肿瘤中的3个）。除非另有说明，n个指生物独立样本；数据为平均值±标准误差。P（P）双尾Welch的γH2AX和cyclin D1值t吨-测试；P（P）双尾非配对Ki67、c-MYC（pS62）、RPA（pS4/8）的值t吨-测试。
扩展数据图8|
扩展数据图8|。AMBRA1缺乏症是CHK1抑制剂的合成致死性疾病。
一，比率介于CHEK1（检查1）中的表达式AMBRA1型-与正常组织相比，癌症的亚群较低。b条，图3c的选通策略。总核DNA强度与γH2AX强度（si）的底部散点图可控硅二甲基亚砜，n个= 1,850; 硅可控硅AZD公司，n个= 1,716; 硅AMBRA1型二甲基亚砜，n个= 1,866; 硅AMBRA1型AZD公司，n个=1731个单元格；代表三个独立实验）。γH2AX-阳性细胞（任意截断）用红色表示。顶部，Hoechst核强度与计数。γH2AX阳性细胞用红线表示。c（c），对照或对照中AMBRA1、RPA（pS4/8）和β-微管蛋白的免疫印迹琥珀色1-未经处理或用AZD7762处理的沉默BJ-hTERT细胞。d日，Left，右侧量化的选通策略。顶部，赫斯特核强度与计数。底部，散点图，报告单细胞总核DNA强度与TUNEL强度。对，根据Hoechst强度计算的不同细胞期TUNEL阳性细胞(n个= 3).P（P）双尾未配对值t吨-测试。电子、控制和AMBRA1型-用指定浓度的LY2603618处理沉默的BJ-hTERT细胞24小时(n个= 3).P（P）两阶段逐步提升的价值观（本杰米尼、克里格和叶库蒂利）。（f），对照组中的细胞存活率，AMBRA1型-和自动液位计7-未经处理或用AZD7762处理24小时的沉默BJ-hTERT细胞(n个=4，用于100 nM AZD7762的对照和处理）。P（P）双尾未配对值t吨-测试。克、对照组和AMBRA1型-未经处理或用奥拉帕林处理24小时的沉默BJ-hTERT细胞(n个= 3). 双尾非配对分析t吨-测试。小时用100 nM AZD7762或5μM LY2603618处理24 h的BJ-hTERT细胞的Fork对称性分析可控硅二甲基亚砜，n个= 533;硅可控硅AZD公司，n个= 560;硅可控硅年，n个= 548; 硅AMBRA1型DMSO中，n个=601；siAMBRA1型AZD公司，n个= 543; 硅AMBRA1型年，n个= 548).P（P）通过双尾Mann–Whitney检验得出的值。数据为平均值±标准差。我，对照组和AMBRA1型-用指定浓度的AZD7762和LY2603618处理沉默的A549、H11299和HCC827肺癌细胞系(n个=3）持续24小时。P（P）两阶段逐步提升的价值观（本杰米尼、克里格和叶库蒂利）。数据为平均值±标准差。j个、对照组中指示蛋白质的免疫印迹或AMBRA1型-沉默A549、HCC827和H1299细胞(n个= 3).k个，肉瘤细胞系的免疫印迹(n个= 3).我，抑制剂MLN4924处理SKUT-1B细胞4小时后的免疫印迹(n个= 3).米左，用野生型AMBRA1或突变型AMBRA2（ΔWD40）或AMBRA1（PXP）重组的SKUT-1B细胞的免疫印迹。对，所示标准化蛋白质水平的密度测定量化(n个= 3).P（P）值采用双侧单因素方差分析，然后进行Sidak多重比较测试。n个用野生型AMBRA1、AMBRA1（ΔWD40）或AMBRA1(n个= 3).P（P）值采用双侧单向方差分析，然后进行Tukey多重比较测试。除非另有说明，n个指生物独立样本；数据为平均值±标准误差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. 精确P（P）数值见补充方法的“统计分析和数据再现性”部分。
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扩展数据图9|。AMBRA1缺乏是体内CHK1抑制剂合成致死的。
一，的细胞活力安布罗1+/+ 和Ambra1总吨位/总吨位用AZD7762或载具处理MEF 24小时(n个=4个独立实验）。P（P）双尾未配对值t吨-测试。b条，方框图（中线，中位数；方框极限，第25和75百分位；胡须，最小值和最大值），表示重量安布拉1+/+ 和Ambra1总吨位/总吨位图3f所示的MEF异种移植物(安布拉1+/++车辆，n个= 8;安布拉1+/++AZD7762，n个= 8;安布拉1总吨位/总吨位+车辆，n个= 10;安布拉1总吨位/总吨位+AZD7762，n个=11只小鼠）。P（P）双尾未配对值t吨-测试。c（c），对照U87-MG细胞或过度表达cyclin D1的细胞死亡百分比，未经治疗或AZD7762治疗24小时；平均值±标准误差(n个=3个独立实验）。P（P）值采用双侧单向方差分析，然后进行Tukey多重比较测试。除非另有说明，数据均为平均值±标准差。
图1|
图1|。AMBRA1通过与DDB1和CLR4相互作用，影响D型细胞周期蛋白的稳定性，从而调节细胞增殖。
一，苏木精和伊红（H&E）染色的野生型（WT；安布罗1flox/flox公司)以及安布罗1cKO公司(安布拉1flox/flox公司::Nestin-cre公司)大脑切片。DPall，背侧大脑皮层；HPC，海马；LV，侧脑室；OB，嗅球；pVZ，大脑皮层脑室区。P4，出生后第4天。比例尺，400μm（顶部）；1 mm（中间，底部）。b条、野生型和安布拉1cKO E13.5胚胎，Ki67和Hoechst染色。方框区域向右放大（8倍放大）(n个= 5). mVZ，中脑心室区；vDPall，心室背侧大脑皮层；心室下丘；vSC，心室上丘。比例尺，250μm。c（c）、野生型提取物中指示蛋白质的免疫印迹安布拉1cKO国家安全委员会(n个= 4).d日、BrdU纳入野生型和安布拉1cKO NSC；指示了BrdU给药的时间点(n个= 3).电子、野生型和安布拉1cKO E13.5胚胎，细胞周期蛋白D1和Hoechst染色。方框区域放大到以下（6倍放大）(n个= 5). 比例尺，250μm。（f）、治疗野生型和安布拉1含环己酰亚胺（CHX）的cKO NSC(n个=3）。克，U87-MG细胞中细胞周期蛋白D1的免疫印迹，其中使用小干扰RNA（siRNA）敲低所指示的E3泛素连接酶的表达(n个=4）。小时在过度表达U87-MG细胞的AMBRA1中，Top，cyclin D1和AMBRA1的联合免疫沉淀(n个= 3). IP，免疫沉淀。底部，AMBRA1调节细胞周期蛋白D1稳定性的模型。我、U2OS细胞中cyclin D1和cyclin D3的免疫印迹，其中指示的cullin蛋白的表达被siRNA敲除(n个= 3).j个，细胞周期指定阶段的细胞百分比(n个= 3). 对细胞进行cyclin D1免疫染色，并用EdU和Hoechst进行复染AMBRA1型mRNA干扰。k个，方框图（中线、中位数；方框限值，第25和75百分位；晶须，最小值和最大值），显示G1相的长度，单位为siAMBRA1型(n个=59个单元格）和对照si可控硅(n个=63个细胞）三个独立实验中的U2OS细胞。除非另有说明，数据均为平均值±标准误差。；n个指生物独立样本。采用双边单因素方差分析和Sidak多重比较检验对数据进行分析(d日)，单因素方差分析，然后是Sidak的多重比较测试(j个)或双尾未配对t吨-测试(k个). NS，不显著。免疫印迹定量如扩展数据图1g、2a、3c所示。
图2|
图2|。AMBRA1的耗尽会导致复制压力。
一，散点图，报告单细胞γH2AX、EdU和Hoechst总核强度AMBRA1型-沉默（siAMBRA1型)和控制（si可控硅)BJ-hTERT细胞（si可控硅,n个=716个单元；硅AMBRA1型,n个=715个单元；代表三个独立实验）。b条，左侧，琥珀色1-沉默和对照U2OS细胞染色γ-微管蛋白（红色），组蛋白H3在Ser10磷酸化（H3（pS10））；绿色）和Hoechst（蓝色）。比例尺，10μm。对，有丝分裂细胞定量显示后期桥和滞后染色体（chr）(n个= 3).c（c），左侧，AMBRA1型-沉默和对照BJ-hTERT细胞RPA（si）免疫染色可控硅,n个=704个单元；硅AMBRA1型,n个=720个单元格）。比例尺，10μm。右图，RPA病灶平均数量的量化以及Hoechst强度与RPA强度的散点图(n个= 3).d日、Top、来自对照组和AMBRA1型-沉默的BJ-hTERT细胞。比例尺，10μm。底部，平均拨叉速度的量化（kb min−1)5-碘-2’-脱氧尿苷（IdU）和5-氯-2’-去氧尿苷的掺入和染色后进行叉对称性分析。划伤的叉子：硅可控硅,n个= 301;siAMBRA1公司,n个= 233. 数据为平均值±标准差。电子、对照组中指示蛋白质的免疫印迹分析或AMBRA1型-沉默的BJ-hTERT细胞。（f）免疫印迹分析对照BJ-hTERT细胞或多西环素（doxycyclin，dox）处理指定天数后诱导细胞周期蛋白D1表达的细胞中的细胞周期素D1和γH2AX。前缀i-和e-分别表示细胞周期蛋白D1的诱导和内源性形式(n个= 3).克、野生型或安布拉1cKO E13.5胚胎，γH2AX抗体染色(n个= 3). 比例尺，40μm。免疫组织化学定量如扩展数据图5l所示。肌动蛋白或β-微管蛋白作为负荷对照。除非另有说明，否则数据为平均值±s.e.m。；n个指的是生物独立的样品。使用双尾非配对分析数据t吨-测试(b条,c（c）)或双尾Mann-Whitney检验(d日).
图3|
图3|。AMBRA1是一种肿瘤抑制物，其损失是通过CHK1抑制合成致死的。
一H&E染色的小鼠肺切片显示肿瘤病变安布拉1-精通(安布拉1+/+：：克拉斯G12D系列/+)以及安布拉1-不足(安布拉1flox/flox公司：：克拉斯G12D系列/+)腺病毒感染20周后的肺组织。显示了四个不同的样品，代表了四只小鼠。比例尺，1 mm。b条感染20周后，对Ki67、γH2AX、RPA（pS4/8）、cyclin D1和c-MYC（pS62）进行免疫组织化学分析。比例尺，40μm。c（c），左侧，AMBRA1型-用100 nM AZD7762处理沉默和对照的BJ-hTERT细胞24小时，并对γH2AX和Hoechst进行免疫染色。比例尺，5μm。对，AZD7762治疗24小时抑制CHK1后pan-γH2AX阳性细胞的定量(n个=3个独立实验）。d日左侧，用AZD7762处理指示的BJ-hTERT细胞24小时，并用TUNEL和Hoechst染色。比例尺，5μm。对，TUNEL阳性细胞平均百分比的量化(n个=3个独立实验）。电子，用对照肉瘤SKUT-1B细胞或用AMBRA1（SKUT-1B-AMB）重建的SKUT-1B细胞异种移植小鼠的存活曲线。用载体或AZD7762治疗小鼠(n个=4只小鼠）。（f），评估安布拉1+/+和安布罗1gt/gtAZD7762或载体治疗小鼠的MEF异种移植物(安布拉1+/++车辆，n个=8，用于第17-21天，n个从第24天起=7；安布拉1+/++AZD7762，n个= 8;安布拉1总吨位/总吨位+车辆，n个= 10;安布拉1总吨位/总吨位+AZD7762，n个=11只小鼠）。数据为平均值±标准差。克，AMBRA1通过介导细胞周期蛋白D蛋白和c-MYC的降解来调节G1–S相变。AMBRA1–cyclin D轴缺陷导致过早进入S期，导致复制应激和基因组不稳定。DNA损伤增加会导致肿瘤更快生长和神经发育缺陷。pRB，磷酸化RB。免疫组织化学定量如扩展数据图7e所示。除非另有说明，否则数据为平均值±标准偏差。使用双尾非配对分析数据t吨-测试(c（c）,d日,（f）)或log-rank Mantel–考克斯测试(电子). 在（f），第23天*P（P）= 0.0348; 第24天，P（P）= 0.0353; 第25天*P（P）= 0.0228; ****P（P）< 0.0001.
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