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。2021年6月：48:101203。
doi:10.1016/j.molmet.2021.101203。 Epub 2021年3月3日。

线粒体顺乌头酸酶缺失通过SCD1介导的脂质重塑促进结直肠癌进展

新友 1, 田靖宇 2, 张慧（音） 2, 郭云华 2, 泾阳 三, 朱朝峰 三, 明松 三, 王鹏（音译） 三, 刘泽贤 三, 约翰·坎西拉 4, 文化路 2, 克里斯托夫·格洛里厄 三, 文世军 三, 杜红丽 5, 彭黄 2, 胡玉敏 6
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线粒体顺乌头酸酶缺失通过SCD1介导的脂质重塑促进结直肠癌进展

新友等。 摩尔金属。 2021年6月。

摘要

目标：线粒体乌头酸酶（ACO2）是连接TCA循环和脂质代谢的必需酶。然而，其在癌症发展中的作用仍有待阐明。结直肠癌（CRC）的代谢亚型是最近确定的。我们通过介导代谢改变来研究ACO2在CRC进展中的潜在作用。

方法：我们比较了353例患者配对CRC和非肿瘤组织中ACO2的mRNA和蛋白表达。检测ACO2水平与临床病理特征之间的相关性。对ACO2敲除或过表达的CRC细胞系进行细胞增殖和肿瘤生长分析。代谢组学和稳定同位素示踪分析用于研究ACO2丢失引起的代谢变化。

结果：与匹配的非肿瘤组织相比，50%以上的CRC样本的ACO2降低。ACO2水平降低与疾病晚期（P＜0.001）和患者生存期缩短（P＜0.001）相关。在CRC细胞中敲除ACO2可促进细胞增殖和肿瘤形成，而ACO2的异位表达可抑制肿瘤生长。具体而言，阻断ACO2导致TCA循环中间产物减少，线粒体氧化磷酸化受到抑制，导致糖酵解增加，脂肪酸和脂质合成的柠檬酸盐流量增加。柠檬酸盐流量增加导致硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）上调，从而增强ACO2缺乏细胞中的脂质去饱和，从而有利于结直肠癌的生长。SCD的药物抑制选择性地减少ACO2缺乏的CRC肿瘤形成。

结论：我们的研究表明，重组代谢途径在受损的TCA周期中维持了CRC的生存，并表征了伴有线粒体功能障碍的有意义的CRC亚群中脂质去饱和的治疗脆弱性。

关键词：结肠癌；脂生成；线粒体顺乌头酸酶；硬脂酰辅酶A去饱和酶；三羧酸（TCA）循环。

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图形摘要
图1
图1
在结直肠癌（CRC）中，经常检测到ACO2表达降低，并与患者预后不良相关。（A） 逆转录聚合酶链反应显示，与中山大学肿瘤中心（SYSU，paired）和（B–C）癌症基因组图谱（TCGA，paired-andunpaired，coarse Genome Atlas）队列中的正常组织相比，CRC组织中ACO2 mRNA表达下调。FPKM，每百万次映射读取的每千碱基转录物的片段。（D） 对9例CRC患者标本的Western blotting分析表明，与相邻正常组织（N）相比，CRC组织（T）中ACO2蛋白表达经常下调。（E） 代表性免疫组织化学（IHC）图像显示CRC组织和邻近正常组织（ANT）中ACO2染色。放大200倍。（F） 比较肿瘤组织和相应非肿瘤组织的IHC染色强度(P（P）<0.001，n=331）。（G-H）ACO2蛋白低表达（SYSU队列，P（P）<0.0001）和mRNA（TCGA队列，P（P）=0.0281）与CRC患者的生存期较短有关。
图2
图2
敲除ACO2可促进大肠癌细胞增殖和肿瘤形成。（A） Western blotting分析在LoVo和HCT116细胞中检测到shRNA敲除ACO2。（B） 敲除ACO2可增强LoVo和HCT116细胞的集落形成。与表达非靶向shRNA（nc）的对照细胞相比，稳定表达shACO2的（C–D）LoVo和HCT116细胞的肿瘤生长速度更快。（E） Ki-67染色显示，ACO2击倒LoVo肿瘤的细胞增殖增加。（F） ACO2在不同CRC细胞中的表达。（G-I）ACO2在HCT116细胞中的异位表达减弱了HCT116的集落形成和肿瘤生长。HCT116载体（转染载体对照）、HCT116-oeACO2（转染含有ACO2的质粒）、oeACO2和ACO2过度表达。棒材，平均值±SD.*P（P）<0.05，***P（P）<0.01和***P（P） < 0.001.
图3
图3
敲除ACO2干扰TCA循环并促进糖酵解活性。（A） 通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析稳定表达非靶向shRNA控制（nc）和shACO2的LoVo细胞的TCA循环代谢物，包括柠檬酸（cit）、异柠檬酸（Isocit）、琥珀酸（Suc）、富马酸（Fum）和苹果酸（Mal）。（B） 糖酵解中间体的GC-MS分析，包括3-磷酸甘油（Glyc3P）、3-磷酸甘油酸（3-PG）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、丙酮酸盐（Pyr）和乳酸（Lac）。（C） 通过Seahorse XF细胞外通量分析检测LoVo-nc和LoVo-shACO2细胞的耗氧率（OCR，线粒体OXPHOS功能指标）。如图所示，在不同时间点依次注射包括寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A（Rtn/AA）的化合物。基础呼吸（顶部和底部蓝色虚线之间的差异）、ATP生成（顶部和下部紫色虚线之间）和最大呼吸（顶部与底部绿色虚线之间差异）。（D） 采用Seahorse XF细胞外通量分析，通过细胞外酸化率（ECAR）监测糖酵解活性。如图所示，在不同的时间点依次注射葡萄糖、寡霉素A和2-DG等化合物。糖酵解（顶部和底部蓝色虚线之间的差异）和糖酵分解能力（顶部和顶部绿色虚线之间差异）。（E） LoVo-nc和LoVo-shACO2细胞（F）的葡萄糖摄取和乳酸生成，线粒体衍生的ATP，以及LoVo-nc和LoVo-shACO2的总ATP生成。棒材，平均值±SD.*P（P） < 0.05, ∗∗P（P）<0.01，和***P（P） < 0.001.
图4
图4
谷氨酰胺氧化增加支持了ACO2损失后柠檬酸盐的生成。（A） 通过Seahorse XF Mito Fuel Flex试验测量ACO2击倒前后葡萄糖和谷氨酰胺对线粒体氧化的贡献。（B） TCA循环中葡萄糖和谷氨酰胺代谢产生柠檬酸和乙酰辅酶A的示意图。红色圆圈和绿色圆圈代表13源自[U–的C原子13C] -葡萄糖和[U–13C] -谷氨酰胺。开放圆表示12C原子。虚线表示多步骤原子跃迁。Cit（m），线粒体柠檬酸盐。Cit（c），细胞溶质柠檬酸盐。Ac-CoA，乙酰-CoA；αKG，α-酮戊二酸；Cit，柠檬酸盐；富马酸；Glc，葡萄糖；谷氨酸；谷氨酰胺；苹果酸；草酰乙酸；丙酮酸；简洁，简洁。（C–D）葡萄糖和谷氨酰胺碳对TCA循环中间体的贡献，通过[U–13C] -葡萄糖（M+2）和[U–13C] -谷氨酰胺（M+4），用同位素培养LoVo细胞24小时。（E） [U–的回复供应和还原羧基化的示意路线13C] -谷氨酰胺。橙色和绿色箭头分别表示TCA循环中的谷氨酰胺氧化和还原代谢。（F） 用[U–13C] 谷氨酰胺。棒材，平均值±SD.*P（P） < 0.05, ∗∗P（P）<0.01和***P（P） < 0.001.
图5
图5
ACO2的损失促进了脂肪酸的合成和β氧化。（A） ACO2击倒后LoVo细胞中乙酰辅酶A积累增强。（B） 与ACO2击倒后LoVo细胞中脂肪酸总量相比，新合成脂肪酸的百分比增加。（C） 通过与对照细胞（NC）相比ACO2敲低（SH）细胞的平均水平来计算肉碱及其衍生物的倍数变化。（D） ACO2击倒后LoVo细胞中马来酰辅酶A浓度降低。（E） 通过Seahorse XF Mito Fuel Flex测试测量了ACO2击倒前后脂肪酸对线粒体氧化的贡献。（F） 总结CRC细胞ACO2丢失后脂肪酸氧化变化的示意图。ACO2的敲除促进了柠檬酸盐对乙酰辅酶A生成和随后脂肪酸合成的通量。丙二酰辅酶A的流量减少释放对CPT（肉碱-棕榈酰转移酶）的抑制。脂肪酰肉碱的上调进一步促进了β氧化。ACLY，ATP柠檬酸裂解酶；脂肪酸合成酶；ACC，乙酰辅酶A羧化酶；MCD，丙二酰辅酶A脱羧酶；乙酰辅酶A合成酶；CPT，肉碱棕榈酰转移酶。棒材，平均值±SD.*P（P） < 0.05, ∗∗P（P）<0.01和***P（P） < 0.001.
图6
图6
敲除ACO2可诱导SCD1表达并增强脂质不饱和度。（A） 当ACO2被击倒时，甘油磷脂（包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂肌醇（PI）、磷脂酰基丝氨酸（PS）、心磷脂（CL）和鞘脂（包括神经酰胺（Cer）和鞘磷脂（SM））增加。ACO2击倒LoVo细胞后，甘油三酯（TG）水平降低。（B） ACO2敲低细胞和对照细胞中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比的定量。（C） LoVo-nc和LoVo-shACO2细胞的总脂质不饱和度（n=5）。用平均脂质水平除以具有所示双键的脂质化合物的数量来计算不饱和度。（D） 单个PC物种显示为双键的数量（0-11）除以FA侧链的长度（碳：C29到C42）。红线表示不饱和度。使用LoVo-shACO2中特定脂质物种的平均水平计算折叠变化，并与以肌动蛋白作为负荷对照的ACO2敲除前后CRC细胞中ACO2、SCD1、FASN、ACLY和SLC25A1的LoVo-nc（Sh/nc）（E）Western blotting分析进行比较。（F） 不同浓度柠檬酸盐处理72小时前后LoVo细胞的Western blotting分析。柠檬酸盐处理导致SCD1表达升高。ACLY和SLC25A1的表达不受影响。（G–H）经载体对照（Veh）或A939572处理的LoVo-nc和LoVo-shACO2细胞的皮下肿瘤体积和最终重量（每组6个肿瘤）。棒材，平均值±SD.*P（P） < 0.05, ∗∗P（P）<0.01和***P（P） < 0.001.
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参考文献

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