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.2021年2月11日9:622344。
doi:10.3389/fcell.2021.622344。 eCollection 2021年。

靶向POLE2通过调节Stanniocarin 1在肾细胞癌中产生新的易损性

张传杰 1, 严慎 2, 高丽丽（Lili Gao） 三, 王晓静 1, 大黄 1, Xin Xie（新谢） 1, 许丹凤 1, 何洪超 1
附属机构

靶向POLE2通过调节Stanniocarin 1在肾细胞癌中产生新的易损性

张传杰等。 前电池开发生物. .

摘要

目标：本研究旨在探讨DNA聚合酶ε亚基2（POLE2）在肾细胞癌（RCC）中的生物学功能及其机制。

方法：选择了癌症基因组图谱肾透明细胞癌（TCGA-KIRC）和国际癌症基因组联合会（ICGC）数据库中POLE2表达的数据集，并分析了POLE2与各种临床病理参数之间的相关性。用免疫组织化学方法检测肾细胞癌组织中POLE2的表达。构建了POLE2敲除细胞系。体外和体内通过细胞活性测定、克隆形成测定、流式细胞术、创伤愈合测定、Transwell分析、qRT-PCR、Western blot等实验研究了POLE2对肾癌细胞生物学的作用，和Western blot用于研究POLE2功能的分子机制。

结果：POLE2在RCC组织中过度表达，POLE2高表达与RCC预后不良相关。此外，POLE2的敲除显著抑制细胞增殖、迁移和促进凋亡在体外.体内实验表明，POLE2可抑制RCC肿瘤发生和肿瘤生长。我们还阐明了stanniocarin 1（STC1）是POLE2的下游基因，它促进了RCC的发生和发展。此外，敲除POLE2显著上调Bad和p21的表达水平，而HSP70、IGF-I、IGF-II、survivin和sTNF-R1的表达水平显著下调。Western blot分析还显示，敲除POLE2可抑制癌相关途径蛋白的表达水平，包括p-Akt、CCND1、MAPK9和PIK3CA。

结论：敲除POLE2通过调节STC1抑制RCC细胞增殖和迁移，提示POLE2-STC1可能成为RCC治疗的潜在靶点。

关键词：极2；迁移；增殖；肾细胞癌；锡酸钙1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
POLE2水平上调并与肾癌的各种临床病理参数相关。RCC中的POLE2 mRNA水平来自癌症基因组图谱肾透明细胞癌数据集（TCGA-KIRC；包含72个正常组织和530个RCC组织）和国际癌症基因组联合会（ICGC；包含44个正常组织及91个RCC组织）。比较不同临床病理参数下的POLE2 mRNA水平：（A、C）癌症与副癌，（B）癌与配对副癌，（D）TNM阶段，以及（E）G阶段。（F）TCGA-KIRC队列中POLE2高或低表达RCC患者总生存率的Kaplan-Meier曲线。（G）RCC和邻近正常组织中POLE2的代表性免疫组织化学染色。（H）高或低POLE2表达的RCC患者总生存率的Kaplan-Meier曲线**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图2
图2
敲低POLE2表达抑制RCC细胞增殖和迁移。（A）MTT法检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498和ACHN细胞的增殖活性。（B）通过以下方法检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498和ACHN细胞的克隆形成能力（B）克隆形成分析。（C）用Transwell法检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498和ACHN细胞的迁移能力。（D）用流式细胞术检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498和ACHN细胞的凋亡率。（E）软琼脂集落形成试验检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498和ACHN细胞的克隆形成能力。（F）Western blot检测感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的A498细胞和ACHN细胞中N-钙粘蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达水平，以GAPDH作为负荷对照。（G）从RCC患者的活检（红圈）中产生PDO并进行培养。（H）用shCtrl或shPOLE2慢病毒转染的三种不同RCC类器官的代表性图像以及类器官直径的量化***P（P）< 0.001. 红色箭头指向类器官。
图3
图3
POLE2基因敲除抑制ACHN细胞的肿瘤发生和肿瘤生长体内.（A）感染shCtrl或shPOLE2慢病毒的ACHN细胞移植瘤的生长曲线，以及在终点检测的肿瘤重量。（B）异种移植模型在终点的荧光强度。（C）异种移植瘤中增殖标记蛋白Ki-67蛋白的免疫组织化学染色。（D）异种移植瘤HE染色*P<0.05，**P<0.01。
图4
图4
POLE2与STC1相互作用。（A）正常ACHN细胞和击倒POLE2ACHN细胞之间DEGs的火山图。（B）经典途径富集分析。（C）灵巧途径分析（IPA）-确定了POLE2与p53信号传导、B细胞受体信号传导和HGF信号传导途径之间的相互作用网络。（D、E）通过以下方法检测与POLE2相关的下游基因的表达水平（D）qRT-PCR和（E）蛋白质印迹。（F）用HCS细胞增殖测定法检测shCtrl、shCDC42EP3、shEZR、shGDAP1、shRDM1或shSTC1慢病毒感染ACHN细胞的细胞增殖活性。（G）用Co-IP实验检测ACHN细胞中POLE2和STC1的相互作用。（H）RCC和邻近正常组织中STC1的代表性免疫组织化学染色*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图5
图5
POLE2通过调节STC1促进RCC细胞增殖和迁移。（A）HCS细胞增殖试验检测对照组、POLE2、NC（OE+KD）、POLE2+shSTC1组的细胞增殖活性。（B）克隆形成实验检测NC（OE+KD）和POLE2+shSTC1组的克隆形成能力。（C，D）NC（OE+KD）和POLE2+shSTC1组的迁移能力通过（C）Transwell分析和（D）创伤愈合试验。（E）采用流式细胞术检测对照组、POLE2、NC（OE+KD）、POLE2+shSTC1组的细胞凋亡率**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6
POLE2对A498细胞凋亡的潜在机制。（A）用人凋亡抗体阵列检测有无POLE2基因敲除的A498细胞中的凋亡相关蛋白。（B）在有或无POLE2敲除的A498细胞中分析人类凋亡抗体阵列的差异。（C）在有或无POLE2敲除的A498细胞中差异表达蛋白的灰度值。（D）在有或无POLE2敲除的A498细胞中，通过western blot证实癌相关通路蛋白，GAPDH作为负荷控制*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图7
图7
POLE2参与RCC生物学功能的机理图。
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