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.2021年5月；6(5):682-696.
doi:10.1038/s41564-020-00860-1。 Epub 2021年2月8日。

神经元miR-138对宿主和病毒基因的调节有利于单纯疱疹病毒1型潜伏期

孙伯强 # 1 2 三, 杨学伟 # 1 2 4, 侯福军 # 1 2, 余晓峰 1 2 5, 王琼艳 1 2, Hyung Suk噢 6, 普里亚·拉贾 6, 让·M·佩索拉 7, 艾米莉亚·A·H·凡尼 7, 谢默斯·麦卡伦 7, 詹娜·莫里斯-爱 7 8, 亚历克斯·H·M·吴 9 10, 乔治·M·丘奇 9 10, 大卫·M·克尼 6, 唐纳德·科恩 7, 潘东丽 11 12
附属公司

神经元miR-138对宿主和病毒基因的调节有利于单纯疱疹病毒1型潜伏期

孙伯强等。 自然微生物. 2021年5月.

摘要

在神经元中高表达的微小RNA miR-138通过靶向病毒ICP0信使RNA来抑制单纯疱疹病毒1型（HSV-1）裂解周期基因，从而促进小鼠的病毒潜伏。我们发现，在小鼠和人类神经元细胞中，过度表达的miR-138也独立于ICP0抑制裂解过程；因此，我们研究了miR-138除了ICP0之外是否还有靶点。使用全基因组RNA测序/光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀，然后短时间干扰候选靶点的RNA敲除，我们确定宿主Oct-1和Foxc1信使mRNA为miR-138的靶点，其基因产物是对HSV-1在神经元细胞中复制重要的转录因子。OCT-1在HSV转录起始中起着已知的作用。FOXC1的过度表达促进了小鼠神经元和神经节中HSV-1的复制，而FOXC1对HSV-1没有影响。FOXC1的CRISPR-Cas9敲除降低了小鼠神经元细胞中的病毒复制、裂解基因表达和miR-138抑制。FOXC1还与ICP0合作减少病毒基因上的异染色质，并弥补了ICP0-null病毒的缺陷。总之，miR-138以ICP0、Oct-1和Foxc1为靶点，抑制HSV-1裂解周期基因并促进表观遗传基因沉默，从而为潜在感染创造有利条件。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

A.H.M.N.和G.M.C.是哈佛大学校长和研究员申请的专利的发明人。有关G.M.C.的完整披露，请访问http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.htmlA.H.M.N.和G.M.C.是联合创始人，在GC Therapeutics，Inc.中拥有股权。其他作者声明他们没有利益冲突。

数字

扩展数据图1。
扩展数据图1。关于miR-138对HSV-1复制影响的其他数据。
一在miR-138和let-7a水平的qRT-PCR分析之前，将Neuro-2a细胞模拟感染或感染指示病毒（MOI=5）16 h。b条在图1b所示的4个独立实验中，分别计算了WT和M138病毒的打乱转染细胞与miR-138转染细胞的平均滴度比，并绘制了图。c（c），293T细胞转染40 nM miRNA模拟物16 h，然后感染WT或M138病毒（左图）或7134（ICP0-null）病毒（右图）48 h（MOI=0.1），然后进行病毒滴度测量。d日与c相同，但Vero细胞被感染（MOI=0.01），miR-138与两个对照组之间未检测到显著差异。对于b，n=4个独立实验。对于c，数据来自4个独立的重复实验，每个条件下有4个生物独立的样本（每个实验的数据在合并前首先归一化为LVmiRM138b-WT病毒组的值），因此n=16个生物独立样本/条件。对于其他面板，n=3（a，c右）、4（d）或8（c左）个生物独立样本。对于所有面板，数据均以平均值±S.D.表示，并通过非配对、双尾t检验（a，b）、双向（c左，D）或单向（c右）方差分析以及Bonferroni的多重比较检验进行分析。
扩展数据图2。
扩展数据图2.miR-138对病毒基因表达的全局影响。
与图1f相同的实验，但绘制了对单个病毒转录物的影响。蓝色和红色条分别表示WT和M138病毒的数据。n=每种条件下3个生物独立样本。每个条形代表扰乱模拟转染细胞的指示转录物的读取计数平均值（归一化为样本的总读取数后）除以miR-138模拟转染的细胞的读取计数。
扩展数据图3。
扩展数据图3.miR-138的表达式，美国11和美国12来自重组病毒。
a、，293T细胞感染M138miR138或M138nomiR138病毒（MOI=5）。在8 hpi时，收集细胞进行RNA纯化和Northern杂交。来自M138miR138感染细胞的RNA与凝胶中合成的miR-138稀释系列一起运行，并与miR-138-探针杂交（左面板）。来自M138nomiR138感染细胞的RNA与凝胶中合成的miR-M138b稀释系列一起运行，并与miR-M138探针杂交（右侧面板）。两个样本的RNA完整性都通过溴化乙锭染色进行了验证，如Northern blot图像下面显示的一组约80个碱基的条带。这个实验进行了一次。b、，Vero细胞感染了底部显示的病毒，MOI为5，在8 hpi时收获，用于对归一化为ICP27 mRNA水平的US11和US12 mRNA水平进行qRT-PCR分析。c、，通过qRT-PCR测定感染指示病毒（MOI=5，8 hpi）的293T细胞的miR-138表达。对于b和c，n=3个生物独立样本和数据表示为平均值±S.D.未转换（b）或对数转换（c）数据通过Bonferroni的多重比较测试进行单向方差分析。
扩展数据图4。
扩展数据图4。关于miR-138表达和控制重组病毒的更多体内数据。
a、，5 dpi时感染WTmiR138和WTnomiR138的TG中的病毒DNA和RNA水平。测量的DNA或RNA分子标记在每个图表的顶部。病毒显示在底部。每个点代表一个TG的值，水平线代表几何平均值。显示的n个数字表示每个条件下使用的小鼠数量。数据通过双尾非配对t检验进行分析。b、，与相同，但比较了WTmiR138R和WTnomiR138。c、，与a相同，但比较了M138miR138R和M138nomiR138。
扩展数据图5。
扩展数据图5。PAR-CLIP实验确定了miR-138的病毒和宿主靶点。
a、，miR-138在293T对照细胞和293T138细胞中的表达。b、，检测miR-138病毒靶点的PAR-CLIP程序，从左到右依次为样品示意图、交联过程示意图、SDS聚丙烯酰胺凝胶的代表性放射自显影图（显示Ago-RNA复合物对应的条带）、后续步骤、，以及显示cDNA文库PCR扩增的琼脂糖凝胶。实验进行了一次。c、，从指示的样本中读取指示序列的计数。日期：，293T细胞与20 nM miRNA模拟物和100 ng/ml质粒共转染48 h，然后使用抗FLAG抗体对FLAG标记的UL39进行Western blot分析，并使用ICP0抗体对ICP0进行分析。这个实验重复了一次，结果相似。e、，Neuro-2a、N2A138和N2A anti138细胞中的miR-138水平。f、，显示N2A anti138细胞中表达的“anti138”序列的图表。该序列具有“硬性诱饵”二级结构。红色和黑色水平线分别表示anti138和miR-138。主结构上方和下方的曲线代表为防止分裂而设计的隆起（多余的核苷酸不与miR-138结合）。克，PAR-CLIP实验中N2A138和N2Aanti138细胞中的miR-138和总读取计数。小时，293T（第1和第3组）和Neuro-2a细胞（第2和第4组）中通过单一PAR-CLIP方法（第1组和第2组）或PAR-CLIP/RNAseq组合方法（第3和第4小组）确定的总位点中5’UTR、CDS或3’UTR位点的分数。与单一PAR-CLIP方法相比，联合方法识别出具有3’UTR位点的靶点分数明显更高（通过Fisher精确测试，293T和Neuro-2a细胞的P=0.034和0.0006）。对于a和e，n=3个生物独立样本和数据表示为平均值±S.D。
扩展数据图6。
扩展数据图6。小鼠TG中Oct-1和Foxc1的低表达。
a、，固定TG冷冻切片用抗Foxc1或抗Oct-1兔一级抗体（红色）或不含兔一级抗原（对照）染色，用小鼠抗Tuj1抗体染色（绿色），用DAPI染色（蓝色）。使用不同的Oct-1抗体对Oct-1获得了类似的结果（数据未显示）。这个实验重复了两次，结果相似。b、，用200 ng/ml Oct-1或Foxc1表达质粒模拟转染或转染Neuro-2a细胞48 h。然后固定细胞，用抗Oct-1抗体或抗Foxcl抗体（绿色）或不含一级抗体染色，并用DAPI（蓝色）染色。这个实验重复了一次，结果相似。
扩展数据图7。
扩展数据图7。HSV1Foxc1和HSV1Fox1delAD病毒的其他结果。
a、，用2 x 10感染小鼠角膜5指示病毒的pfu/eye。在1dpi采集的眼拭子中测定病毒滴度。b、，在感染后（如a），在31 dpi时采集TG，并分析病毒基因组水平是否符合小鼠标准脂肪酶qPCR检测基因水平。c、，感染后如a所示，在5 dpi时采集TG，并测定TG中的病毒滴度。日期：，模拟感染（左）或小鼠角膜感染2 x 105通过DAPI（蓝色）和可以检测FLAG标记的Foxc1和Foxc1delAD蛋白的抗FLAG抗体（绿色）对HSV1Foxc1delAD的pfu/眼（中）或HSV1Foxc1（右）的固定TG冷冻切片进行染色。这个实验进行了一次。e、，角膜接种2 x 10后5所示病毒的pfu/eye、小鼠TG在29 dpi时采集，并分析病毒基因组水平是否与小鼠标准化脂肪酶qPCR检测基因水平。在e组中未发现显著差异。对于所有面板，n个数字代表每种情况下使用的小鼠数量。水平线代表几何平均值。数据通过双尾、非配对t检验（a、b、c）或单因素方差分析（ANOVA）以及Bonferroni的多重比较检验（e）进行分析，并显示P值。
扩展数据图8。
扩展数据图8。富士康1对病毒基因表达的整体影响。
a、，图6b的附加数据。用200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞40 h。然后添加KOS（MOI=2）。细胞在4°C下孵育1 h以允许附着，用PBS洗涤并在37°C下培养2 h，然后对顶部显示的转录物进行qRT-PCR分析，以归一化为宿主GAPDH公司水平。n=6个生物独立样本。水平线代表平均值。数据通过双尾非配对t检验进行分析。b、，在RNAseq分析之前，用200 ng/ml pcDNA或pFoxc1human转染Neuro-2a细胞40 h，并在MOI为1时用KOS感染5 h。n=3个生物独立样本。每个条形代表pFoxc1人转染细胞中指示转录物的平均读取计数（通过该样本的总读取数进行归一化后）除以pcDNA转染细胞的平均读取数。
扩展数据图9。
扩展数据图9。Foxc1对HSV-1复制和基因表达很重要。
a、，左侧，富士康1CDS被描绘成一个蓝色方框，DBD为绿色。下面展开的是N2AFoxc1KO细胞中的缺失区域，显示WT和KO细胞系中的序列。引导RNA靶识别所需的PAM序列显示为绿色，靶序列显示为红色。右侧，通过Western blots分析Neuro-2a和N2AFoxc1KO细胞中Foxc1相对于β-微管蛋白（负载控制）的表达。这个实验重复了两次，结果相似。b、，将KOS（MOI=0.5）感染Neuro-2a和N2AFoxc1KO细胞达指定时间。显示平均病毒滴度±S.D。c、，图6e的附加数据。用400 ng/ml pcDNA或pFoxc1human转染N2AFoxc1KO或Neuro-2a细胞。40小时后，在顶部显示的转录物的qRT-PCR分析之前，用MOI为1的KOS感染细胞5小时。水平线代表几何平均值。数据通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较检验进行分析。对于b和c，n=3个生物独立样本/条件。
扩展数据图10。
扩展数据图10。Foxc1减少了与病毒基因相关的异染色质。
如图所示，将500 ng/ml pcDNA或pFoxc1human转染Neuro-2a细胞40 h，并感染KOS 2 h（MOI=2），然后进行ChIP-qPCR分析H3K9me3与底部所示基因的关联。n=3个生物独立样本。显示了平均值±S.D。数据通过双向方差分析和Bonferroni的多重比较检验进行分析。
图1。
图1.miR-138对Neuro-2a细胞中病毒复制的ICP0非依赖性抑制。
a、，miR-138的序列及其在ICP0公司3'UTR、M138突变和合成miRNA模拟物。下划线为种子区域。箭头指向核苷酸替换。b、，用10 nM miRNA模拟物转染Neuro-2a细胞16 h，然后在病毒滴度测量前以1倍感染率（MOI）感染48 h。c、，与b相同，只是转染了40 nM miRNA模拟物，细胞感染了7134病毒（MOI=5）。d日用表达miR-138的慢病毒（LVmiR138）或miR-138-种子区突变为miR-M138b（LVmiRM138b）的慢病毒转导从iPSC分化的人类神经元，然后感染WT或M138病毒（MOI为1）48小时，然后进行病毒滴度测量。数据来自4个独立的重复实验，每个条件下有4个生物独立的样本（每个实验的数据在合并前首先归一化为LVmiRM138b-WT病毒组的值），因此n=16个生物独立样本/条件。e、，用40nM miRNA模拟物转染Neuro-2a细胞16小时，然后在Western印迹分析之前感染（MOI=5）7或12小时。这个实验重复了一次，结果相似。f、，用40 nM LNA转染Neuro-2a细胞8 h，然后感染（MOI=3）16 h，然后进行Western blot分析。这个实验重复了三次，结果相似。克，用40 nM miRNA模拟物转染Neuro-2a细胞24小时，然后感染（MOI=10）16小时，然后进行RNAseq分析。小时，用100 ng/ml荧光素酶质粒和16 nM miRNA模拟物共同转染Neuro-2a细胞24 h，然后用M138病毒感染（MOI=1）6 h，然后测量荧光素素酶活性。我，将60 nM miRNA模拟物转染Neuro-2a细胞24 h，然后感染M138病毒（MOI=5）6 h，然后在ICP27和ICP4启动子处对总组蛋白H3（H3）、H3K9me3（K9）和H3K27me3（K27）进行ChIP-qPCR分析。通过双向重复测量ANOVA和Holm-Sidak的多重比较试验分析2个实验（共5个生物独立样本）中每个实验的平均值的对数转换，以了解miRNA处理因子的主要影响。对于其他小组，n=3（b，g，h）或4（c）个条件下的生物独立样本，数据通过Bonferroni多重比较测试的单向（c，h）方差分析或双向（b，g）方差分析进行分析。数据表示为平均值±标准偏差（S.D.）。
图2。
图2…miR-138降低了急性感染小鼠TG中病毒基因的表达。
a、，插入的miR-138表达序列的基因组定位。HSV-1基因组被描绘为顶部带有长（TR）的水平线L（左）和IRL（左）)和短（IRS公司和TRS公司)重复显示为灰色框的序列。下面，插入位置展开，条形代表CDS，箭头代表mRNA。插入的序列进一步扩展，以显示与左图所示重组病毒对应的miR-138和miR-M138b序列（带下划线的种子区域）。病毒派生的顺序由连接病毒名称的箭头指示。b、，qRT-PCR测定感染所示重组病毒（8 hpi，MOI=10）的Neuro-2a细胞的miR-138表达（相对于let-7a表达）。n=每种条件下3个生物独立样本。数据表示为平均值±S.D。c、，小鼠角膜接种2 x 10后，1 dpi时眼拭子中的病毒滴度5指示病毒的pfu/eye。日期：，病毒转录水平（通过qRT-PCR测量）归一化为5 dpi下TG中带有指示病毒的病毒基因组水平（通过q PCR测定）。对于c和d，每个点表示一个鼠标（c）或TG（d）的值，水平线表示几何平均值，使用的鼠标数量（n）显示在水平轴上方。对于b、c和d，数据通过单因素方差分析和Bonferroni的多重比较进行分析。
图3
图3。使用PAR-CLIP/RNAseq/siRNA筛选确定miR-138的宿主靶点。
a、，用于执行和分析PAR-CLIP和RNAseq的程序概述。b、，顶部是使用a中获得的列表生成的维恩图。维恩图下方的4个框显示了RNAseq列表和CLIP-CDS、CLIP-5UTR或CLIP-3UTR列表中发现的基因列表。紫色箭头从维恩图中的基因位置指向方框中的基因。293T细胞和Neuro-2a细胞中发现的基因以粗体字母显示。c（c），siRNA实验基因的进一步选择标准。d日用80 nM的指示siRNA转染Neuro-2a细胞，并在48 hpi时收获，用于Oct-1（左）、Foxc1（右）和β-actin（两者）的Western blot分析。这些实验重复了一次，得到了类似的结果。e、，将80 nM的siRNAs转染Neuro-2a细胞以对抗所示基因48小时，然后感染WT病毒（MOI=0.1）48小时，再进行病毒滴度测量。n=每种情况下3或4个生物独立样本。数据以平均值±S.D表示。带虚线的方框表示与Control2 siRNA相比，siRNA显著降低病毒滴度（P<0.01，Bonferroni多重比较试验的单向方差分析）。
图4。
图4：miR-138对Oct-1和Foxc1表达的抑制。
a、，miR-138结合位点10月1日CDS。水平线表示10月1日mRNA。粗绿色箭头表示10月1日CDS。两个小的橙色框表示miR-138结合位点，显示了其序列以及它们如何与miR-38配对（种子区域下划线）。b、，在Western blot分析之前，将40 nM miRNA模拟物和100 ng/ml Oct-1表达质粒共同转染到293T细胞中30 h。这个实验重复了两次，结果相似。c、，与b相同，但使用表达WT人类Oct-1或其在位点1（M1）、位点2（M2）或两个位点（M12）突变的变体的质粒。这个实验重复了一次，结果相似。日期：，Foxc1 mRNA和荧光素酶结构用粉红色横条表示富士康1mRNA和嵌入的绿色箭头代表富士康1CDS。两个小的橙色框表示miR-138结合位点，显示了其序列以及它们如何与miR-38配对（种子区域下划线）。蓝色X表示突变位点。e、，用40 nM miRNA模拟物和100 ng/ml质粒共同转染左、中、293T细胞，并在48小时后收获用于荧光素酶活性测定。对，293T细胞与人或小鼠共转染20 nM miR-138模拟物、20 nM micR-138或对照LNA和40 ng/ml荧光素酶质粒富士康1在48小时收获前进行荧光素酶活性测定。RLU，相对荧光素酶单位。数据通过双尾非配对t检验进行分析。f、，用80 nM miRNA模拟物或20 nM LNA转染293T或Neuro-2a细胞，并在转染后72 h进行Western blot分析。未转染细胞裂解液的稀释度显示为无、无/3等。重复此实验一次，结果相似。克,10月1日和富士康1通过qRT-PCR分析从小鼠TG纯化的Neuro-2a细胞和神经元中的mRNA水平。对于e和g，n=每种条件下3个生物独立样本，数据表示为平均值±S.D。
图5。
图5：Foxc1促进HSV-1在神经元细胞和小鼠TG中的复制。
a、，全长人类Foxc1及其缺失突变体的示意图。显示了激活域（AD）、DNA-结合域（DBD）和抑制域（ID）的位置。b、，在Western blot分析之前，用200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞24 h。这个实验重复了一次，结果相似。c、，将200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞24 h，然后感染KOS（MOI=0.1）48 h，然后进行病毒滴度测量。d日，从小鼠TG中分离神经元，培养并用指示的AAV转导5天，然后用HSV1GFP（MOI＝2）感染。72 hpi时，将其固定并用抗FLAG抗体染色，以检测FLAG标记的Foxc1和Foxc1delAD蛋白（蓝色）以及抗Tuj1抗体（红色）。这个实验重复了两次，结果相似。e（电子）在d中描述的实验中，收集上清液以进行病毒滴度测量。f、，等同于e（电子）除MOI为10外，使用了不同的AAV和时间点，如图所示。克，显示插入位置的重组病毒示意图。小时，小鼠角膜接种4 x 104检测pfu/eye、眼拭子病毒滴度。我，接种后（如h），在3 dpi时收集的小鼠TG进行病毒滴度分析。j个，接种2 x 10后18天5pfu/眼，小鼠面部病变严重程度评分：0，无病变；1、小面积轻度病变；近一半的面部被病灶覆盖；3、大部分面部被病灶覆盖。数据通过双尾、配对（h）或非配对（i）t检验、单向（c，j）或双向（e，f）方差分析和Bonferroni的多重比较检验进行分析。对于c、e和f，每个点代表一个生物独立样本（n=3到8）。对于h、i和j，每个点代表一只老鼠（h、j）或TG（i）。使用的小鼠数量以n个数字表示。对于e和f，数据表示为平均值±S.D。对于c、h和I，水平线表示几何平均值。
图6。
图6 Foxc1对Neuro-2a细胞中HSV-1基因表达和异染色质的影响。
a、，将200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞24 h，然后感染KOS（MOI=5），然后进行Western blot分析。b、，用200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞40 h，然后在4°C下与KOS（MOI=2）孵育1 h以允许附着，然后在37°C下孵育2 h，然后进行RNA水平的qRT-PCR分析。c、，对于连接的分析（左），在转染和连接后，如在b中，在病毒基因组的qPCR分析之前清洗细胞。为了分析核进入（右），在37°C下孵育2小时（或在附着后立即确定背景），分离核部分并通过qPCR分析病毒基因组。d日Western blot分析前，用KOS（MOI=5）感染Neuro-2a或N2AFoxc1KO细胞。e、，用400ng/ml质粒转染N2AFoxc1KO或Neuro-2a细胞，然后在qRT-PCR分析之前用KOS感染5小时（MOI＝1）。（f）用20 nM miRNA模拟物转染Neuro-2a或N2AFoxc1KO细胞，并用KOS（MOI=0.5）感染48 h，然后进行滴度测量。克用500 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞40 h，感染KOS或7134病毒（MOI=2），然后在指定启动子处进行组蛋白H3和H3K9me3的ChIP-qPCR分析。对数转换数据通过多重t检验进行分析，并使用Holm-Sidek方法对多重比较进行校正。当pcDNA和pFoxc1delID之间的差异显著时，P值显示在所比较的点下（红色表示KOS，蓝色表示7134）。小时，将200 ng/ml质粒转染Neuro-2a细胞，然后感染14 h（MOI=5，左）或48 h（MOI=0.1，右），然后进行病毒滴度分析。对于所有面板，x=6（b，c）或3（e，f，g，h）生物独立样本。误差条的水平线或中心表示平均值。误差条代表S.D.数据通过双尾非配对t检验（b，c）或双向方差分析（ANOVA）与Bonferroni的多重比较检验（e，f，h）进行分析。我，神经元特异性miR-138对裂解潜伏开关的调节模型。
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参考文献

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