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。2021年1月13日；11（1）：850。
doi:10.1038/s41598-020-79664-6。

γ-干扰素增强间充质干细胞对实验性肾纤维化的治疗作用

Ryo Kanai先生 1, 中岛阿尤木 2 三, Shigehiro Doi先生 1, 木村东彦（Tomoe Kimura） 1, 吉田健 1, 前田佐治 4 5, 石内直树 1, 山田由美 1, 武士·艾克 1, Toshiki Doi公司 1, 加藤由纪夫 4 5, 高雄正木 6
附属机构

干扰素-γ增强间充质干细胞对实验性肾纤维化的治疗作用

Ryo Kanai先生等人。 科学代表。 。

摘要

用于治疗目的的间充质干细胞（MSCs）可被损伤组织中自然杀伤细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）激活，并发挥抗炎作用。这些过程需要相当长的一段时间，导致骨髓间充质干细胞的治疗效果延迟。在本研究中，我们研究了IFN-γ预处理是否可以增强缺血再灌注损伤（IRI）和单侧输尿管梗阻大鼠MSCs的抗纤维化能力。与未经IFN-γ治疗的对照MSC相比，给予IFN-γ处理的MSC可显著减少炎症细胞的浸润，改善间质纤维化。此外，从IFN-γ处理的MSCs中获得的条件培养液比从对照MSCs中得到的条件培养基更有效地减少了由转化生长因子-β1诱导的培养细胞中的纤维化变化。最值得注意的是，用IFN-γ治疗后，MSCs分泌的前列腺素E2显著增加。从IFN-γ处理的MSCs获得的条件培养液中前列腺素E2增加，导致免疫抑制的CD163和CD206阳性巨噬细胞极化。此外，在IRI大鼠中，前列腺素E合成酶的敲除减弱了IFN-γ治疗MSCs的抗纤维化作用，表明前列腺素E2参与了IFN-β的有益作用。使用干扰素-γ治疗的MSCs可能是一种有希望的预防肾纤维化进展的治疗方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

广岛大学生物医学与健康科学研究生院干细胞生物学与医学系是由TWOCELLS有限公司资助的合作研究实验室。Maeda博士是TWOCELLS Company，Limited研发总部研发二部的副部门经理。名誉教授加藤是TWOCELLS有限公司的副总裁。除上述披露外，所有作者均声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1
缺血再灌注损伤（IRI）后肾脏中高迁移率族蛋白-1（HMGB1）、白细胞介素-18（IL-18）和干扰素-γ的表达。在IRI程序后1天（IRI后第1天）和7天（IRI7后）处死大鼠，并评估HMGB1、IL-18和IFN-γ的表达。(一)大鼠肾皮质HMGB1的Western blot分析。蛋白质水平标准化为GAPDH水平（n = 每组5人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来源于相同的实验，凝胶是平行处理的。(b条)肾脏切片中IL-18和IFN-γ的代表性免疫组织化学染色（标尺，100µm）。(c（c）)IL-18和IFN-γ阳性区域的定量（n = 每组5人）。数据表示为平均值 ± 标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01. Sham，非IRI程序。
图2
图2
IFN-γ处理的间充质干细胞（MSCs）对IRI大鼠肾脏的抗纤维化作用。在IRI诱导后立即注射IFN-γ处理或未处理的大鼠MSCs。21天后，用western blot检测纤维化标志物的蛋白水平(一)和免疫组织化学(b条,c（c）)分析。(一)大鼠肾皮质α-SMA和TGF-β1的Western blot分析。蛋白质水平标准化为GAPDH水平（n = 每组5人）。印迹是从同一凝胶的不同部分截取的图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来自相同的实验，凝胶是并行处理的。(b条)肾脏切片中α-SMA、I型胶原（Col-I）和III型胶原（Col-III）的代表性免疫组织化学染色。（比例尺，100µm）。(c（c）)α-SMA-、Col-I-和Col-III-阳性区域的量化（n = 每组5人）。数据表示为平均值 ± 标准偏差**对 < 0.01. Sham，非IRI程序；PBS、PBS注射；对照组大鼠骨髓间充质干细胞注射；IFN-γrMSCs，注射IFN-γ处理的rMSCs。
图3
图3
IFN-γ处理的MSCs对IRI大鼠的抗炎作用。通过免疫染色，在IRI后7天评估MSC注射IRI大鼠肾脏损伤后T细胞和巨噬细胞的浸润情况。(一)大鼠肾脏切片中CD3、CD68、CD163和CD206的代表性免疫组织化学染色（比例尺，100µm）。(b条)CD3-、CD68-、CD163-和CD206-阳性细胞的定量（n = 每组5人）。数据表示为平均值 ± 标准差**对 < 0.01. 缩写如图2所示。
图4
图4
干扰素-γ治疗的MSCs对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠的抗纤维化作用。在UUO手术后4天注射给予或不给予IFN-γ治疗的大鼠MSCs。11天后，通过western blot评估纤维化标记物的蛋白水平(一)和免疫组织化学(b条,c（c）)分析。(一)大鼠肾皮质α-SMA的Western blot分析。蛋白质水平标准化为GAPDH水平（n = 每组5人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来自相同的实验，凝胶是并行处理的。(b条)大鼠肾切片中α-SMA、Col-I和ColIII的代表性免疫组织化学染色（比例尺，100µm）。(c（c）)α-SMA-、Col-I-和Col-III-阳性区域的量化（n = 每组5人）。数据表示为平均值 ± 标准偏差**对 < 0.01. Sham，非UUO程序；图2图例中定义了其他缩写。
图5
图5
IFN-γ处理的人MSCs（hMSCs）对TGF-β/Smad信号通路和巨噬细胞表型变化的旁分泌作用。(一,b条)在HK-2细胞之后，人类近端肾小管细胞系,用IFN-γ处理或未处理hMSCs获得的条件培养基（CM）培养24 h，用TGF-β1处理细胞30 min(一)或24小时(b条). (一)HK-2细胞磷酸化Smad2（p-Smad2）和Smad2的Western blot分析。p-Smad2蛋白水平归一化为Smad2水平（n = 每组5人）。(b条)HK-2细胞中α-SMA的Western blot分析。α-SMA蛋白水平归一化为GAPDH水平（n = 每组5人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来源于相同的实验，凝胶是平行处理的。未经IFN-γ处理的hMSCs、CM对照；干扰素-γ-人骨髓间充质干细胞，来自经干扰素γ处理的人骨髓间质干细胞的CM。(c（c）)在IFN-γ刺激后24或48小时，通过ELISA评估人骨髓间充质干细胞CM中PGE2的浓度。HK-2细胞作为阴性对照（n = 每组5人）。HK-2，来自HK-2细胞的CM。(d日)通过CD163和CD68蛋白水平评估巨噬细胞的表型变化。为了诱导单核细胞THP-1细胞分化为巨噬细胞，用PMA处理细胞48小时。诱导的THP-1细胞与来自IFN-γ处理或未处理hMSCs的CM孵育。48小时后，收集细胞并进行CD163、CD206和CD68的western blot分析。CD163和CD206蛋白水平归一化为GAPDH和CD68水平（n = 每组5人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来自相同的实验，凝胶是并行处理的。数据表示为平均值 ± 标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图6
图6
IFN-γ处理MSCs中前列腺素E合成酶（PTGES）siRNA对巨噬细胞从M1到M2表型变化的抑制作用。(一)用PMA刺激THP-1单核细胞48小时，然后用转染阴性对照（NC）siRNA或PTGES siRNA的IFN-γ处理hMSCs中的CM孵育。48小时后，收集细胞并进行CD163和CD68的western blot分析。CD163蛋白水平归一化为GAPDH和CD68水平（n = 每组5人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了全长凝胶图像。样品来自相同的实验，凝胶是并行处理的。数据表示为平均值 ± 标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图7
图7
PTGES siRNA对IFN-γ治疗的IRI大鼠骨髓间充质干细胞抗纤维化作用的抑制作用。转染NC siRNA或PTGES siRNA的rMSCs经IFN-γ处理后，在IRI诱导后立即注入大鼠体内。21天后，通过western blot和免疫组织化学分析评估肾脏纤维化标记物的蛋白水平。(一)通过ELISA（n = 每组5人）。(b条,c（c）)IRI大鼠肾皮质α-SMA和TGF-β1的Western blot分析。蛋白质水平标准化为GAPDH水平（n = 每组4人）。斑点是同一凝胶不同部分的裁剪图像。补充文件中提供了完整的凝胶图像。样品来自相同的实验，凝胶是并行处理的。Sham，非IRI程序；PBS、PBS注射；NC siRNA，注射转染NC siRNA的IFN-γrMSCs；PTGES siRNA，注射转染PTGES siRNA的IFN-γrMSCs(d日)肾脏切片中α-SMA和Col-III的代表性免疫组织化学染色（比例尺，100µm）。(电子)α-SMA-和Col III阳性区域的定量（n = 每组4人）。数据表示为平均值 ± 标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01.
图8
图8
DAMP和干扰素-γ治疗MSCs对肾纤维化的影响。(一)HMGB1和IL-18是DAMPs的成员，据报道HMGB1促进MSCs迁移，而IL-18促进IFN-γ的分泌。损伤组织中自然杀伤细胞分泌的IFN-γ激活MSC，发挥抗炎作用。然而，这种激活需要很长一段时间，这会延迟用于治疗目的的MSC的作用。(b条)IFN-γ刺激促进MSCs分泌前列腺素E2，增加的前列腺素E_2诱导免疫抑制CD163阳性巨噬细胞极化，抑制炎症持续。用IFN-γ处理的MSCs也直接抑制促纤维化TGF-β1/Smad信号传导，从而预防纤维化。
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