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。2021年3月；64(3):308-317.
doi:10.1165/rcmb.2020-0149MA。

气道上皮细胞亚群的流式细胞术分析与纯化

卢克·博泽 1 2, Kyung Duk Koh公司 1 2, 克里斯蒂娜·约翰逊 三 4 5, 塞米尔·普·乔克西 2, 丹成（Dan Cheng） 1 2 6, 刘乐谦 7, 定远一孙 8, 洛娜·T·兹洛克 8, 沃尔特·埃克尔巴 1 9, 沃尔特·芬克贝纳 8, 大卫·J·埃尔勒 1 2 9
附属机构

气道上皮细胞亚群的流式细胞术分析和纯化

卢克·邦瑟等。 Am J Respir细胞分子生物学。 2021年3月。

摘要

人体气道上皮细胞在体内平衡中至关重要，而上皮细胞功能障碍会导致慢性气道疾病。发展流式细胞仪方法来表征气道上皮细胞亚群将有助于进一步解剖气道上皮生物学。利用单细胞RNA测序数据，结合已知的细胞类型特异性标记物，我们开发了一组抗体，用于从人类支气管上皮细胞培养物中鉴定和分离主要气道上皮亚群（基底细胞、纤毛细胞和分泌细胞）。我们还鉴定了分泌细胞的不同分子亚群，并证明了低丰度转录物和microRNAs的细胞亚特异性表达，这对当前单细胞RNA-测序方法的分析具有挑战性。这些新工具将有助于分析和分离气道上皮亚群，并询问气道上皮生物学。

关键词：气道上皮；流式细胞术；单细胞RNA测序。

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数字

图1。
图1。
流式细胞术细胞特异性标记物的鉴定。(一个)使用针对细胞亚群特异性标记物的抗体对在无IL-13（青色直方图）或有IL-13的情况下生长的人类支气管上皮细胞（HBEC）进行染色。阳性染色是通过将同一样本染色与适当的同型对照（灰度直方图）进行比较来确定的。直方图表示一个供体的单个实验数据；采集了10000个细胞的数据。(B类)未刺激和IL-13刺激HBEC的细胞亚群特异性标记物阳性染色的比较（来自n个 = 5人；每个供体用不同的颜色表示）。采用Wilcoxon符号秩检验评估显著性：*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01. CDHR3型 = 钙粘蛋白相关家族成员3人；电子摄影机 = 癌胚抗原相关细胞粘附分子5；ITGA6公司 = 整合素亚基α6；NGFR公司 = 神经生长因子受体；纳秒 = 不显著；坦桑尼亚8 = 四spanin-8；大号 = 乙酰化α-微管蛋白。
图2。
图2。
使用分析流式细胞仪分析气道上皮细胞亚群和IL-13刺激的特征。HBEC(n个 = 5名供体）在加入或不加入IL-13的情况下进行培养，并进行多色流式细胞术处理。获得了来自单个复制的10000个细胞的数据。(一个–E类)从非刺激性（IL-13）中识别气道上皮亚群的门控策略−)和IL-13刺激（IL-13+)HBEC。(一个)双人床和(B类)碎片被清除，由此产生的单衣被关上(C)NGFR和TUBA。(D类)随后，TUBA−NGFR公司−单胞菌在ITGA6和CEACAM6上进行门控。(E类)ITGA6公司−CEACAM6号机组+然后用MUC5AC和TSPAN8对细胞进行门控。后续分析步骤中使用的特定门用红色表示。阳性抗体染色用荧光-减一对照测定。尽管CDHR3和CEACAM5抗体也包括在小组中，但由于分别与TUBA和CEACAME6染色有大量重叠，因此它们没有用于我们的标准门控方法。(F类)四种主要上皮亚群（B1+2；纤毛[Cil]，TUBA）的量化+NGFR公司−; 分泌型[Sec]，TUBA−NGFR公司−CEACAM6号机组+ITGA6公司−; 和戈布，TUBA−NGFR公司−CEACAM6号机组+ITGA6公司−坦桑尼亚8+MUC5AC公司+)来自未刺激的（IL-13−)和IL-13刺激（IL-13+)HBEC来源于两名无呼吸道疾病史的患者（NAD，粉红色）和三名间质性肺病患者（ILD，青色）。黑色条代表HBEC的平均值，与疾病史无关。(G公司–R（右）)在降采样后，将来自三个供体各3000个细胞的流式细胞仪结果进行合并，并通过以下方法进行分析：t吨-分布式随机邻居嵌入。这个t吨-将分布的随机相邻嵌入图着色，以显示染色的纤毛细胞标记的细胞(G公司)TUBA和(H（H）)CDHR3（红色），基底细胞标记物(我)NGFR和(J型)ITGA6（蓝色）和分泌细胞标记(K（K）)CEACAM6(L（左）)CEACAM5(M（M）)TSPAN8和(N个)MUC5AC（绿色）。未染色的细胞显示为灰色。(O（运行）)FSC和(P（P）)SSC表示为从低（蓝色）到高（红色）的连续统。细胞来源于未经刺激的(−; 青色）或IL-13刺激(+; 粉红色）(问)三种文化(R（右）)个人(R（右）)（该R（右）应该在个人之后，而不是三个人之后；类似地(问)可以移到前面3个单词的文化之后）（捐赠者A、B和C）**P（P） < 经Wilcoxon秩和检验，未刺激组与IL-13刺激组的差异为0.01。地下一层 = 大号−NGFR公司+; B2级 = 大号−NGFR公司−CEACAM6号机组−ITGA6公司+; B1+2层 = B1和B2之和；金融稳定委员会 = 前向散射；采空区 = 高脚杯；ILD公司 = 间质性肺疾病；北美 = 无呼吸道疾病史；纳秒 = 不显著；子系统控制器 = 侧面散射。
图3。
图3。
HBEC亚群的流式细胞术分类。流式细胞仪处理前，每个HBEC有六个12-mm Transwell(n个 = 3名供体）在无IL-13或有IL-13的培养液中用SiR-tubulin染色。将SiR-微管蛋白染色的细胞进行胰蛋白酶化，用细胞活性染料染色，并通过流式细胞仪进行细胞分选。(一个–E类)非刺激（IL-13）流式细胞分选的门控策略−)和IL-13刺激（IL-13+)代表捐赠者的HBEC。选择后(一个)单件和(B类)活细胞，细胞被选通(C)SiR-微管蛋白和NGFR染色。(D类)SiR-微管蛋白−细胞在NGFR和CEACAM6上进行门控。(E类)NGFR公司−CEACAM6号机组+细胞在CEACAM6和TSPAN8上进行门控。在随后的分析步骤中使用的特定门/象限用红色标出(F类和G公司)为了验证SiR-tubulin染色+细胞固定在多聚甲醛中，用胞浆固定在载玻片上，用TUBA（青色）染色，用DAPI（品红色）复染。图像显示了来自(F类)未刺激（IL-13−)和(G公司)IL-13刺激（IL-13+)用TUBA染色的纤毛培养（在检测的58/60个细胞中发现）。比例尺，10μM。(H（H）)分类细胞亚群的qRT-PCR分析。从不同供体的三次重复实验中计算的平均表达值(n个 = 3） 标准化为该基因在任何细胞类型中的最大表达（0–1：白色到红色）。CFTR公司 = 囊性纤维化跨膜电导调节因子；DCLK1型 = 双皮质素样激酶1；福克斯J1 = 叉头箱J1；韩元5 = 细胞角蛋白5；miR公司 = 微RNA；马来西亚令吉 = MYB原癌基因，转录因子；项目风险评估1 = 富含脯氨酸蛋白BstNI亚家族1；SCGB1A型 = 分泌球蛋白家族1A成员；SPDEF公司 = SAM点域-含ETS转录因子；TSLP公司 = 胸腺基质淋巴细胞生成素；TUBA1A公司 = 微管蛋白α1A 1类。
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