Actin R256 Mono-methylation Is a Conserved Post-translational Modification Involved in Transcription

doi:10.1016/j.celrep.2020.108172

.2020年9月29日；32(13):108172.

doi:10.1016/j.celrep.2020.108172。

肌动蛋白R256单甲基化是转录中一种保守的翻译后修饰

附属公司

¹美国德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心细胞和分子生物学系，邮编75708。
²美国得克萨斯州史密斯维尔得克萨斯大学安德森癌症中心科技园研究部表观遗传学和分子致癌学系，邮编78957。
^三美国得克萨斯州史密斯维尔得克萨斯大学安德森癌症中心科技园研究部表观遗传学和分子致癌学系，邮编78957；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心UT健康生物医学研究生院，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
⁴德克萨斯大学西南医学中心生理学系，美国德克萨斯州达拉斯75390。
⁵宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学系真核基因调控中心，宾夕法尼亚州立大学公园，宾夕法尼亚16802，美国。
⁶德克萨斯大学奥斯汀分校ICMB蛋白质组学设施，美国德克萨斯州奥斯汀78712。
⁷结构生物信息学实验室，生物系统动力学研究中心，RIKEN，1-7-22 Suehiro，Tsurumi，Yokohama，Kanagawa 230-0045，Japan。
⁸美国德克萨斯州休斯顿市麦戈文医学院德克萨斯大学休斯顿健康科学中心内科。
⁹佛蒙特大学分子生理学和生物物理系，美国佛蒙特州伯灵顿，邮编05405。
¹⁰美国德克萨斯州史密斯维尔市德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心科学园研究部表观遗传学和分子致癌系，邮编78957。电子地址：xshen@mdanderson.org。
¹¹美国德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心细胞和分子生物学系，邮编75708。电子地址：pkapoo02@amgen.com。

PMID： 32997990
预防性维修识别码： PMC8860185型
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2020.108172

肌动蛋白R256单甲基化是转录中一种保守的翻译后修饰

阿肖克·库马尔等。单元格代表. 2020.

.2020年9月29日；32(13):108172.

doi:10.1016/j.celrep.2020.108172。

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¹美国德克萨斯州泰勒市德克萨斯大学健康科学中心细胞和分子生物学系，邮编75708。
²美国德克萨斯州史密斯维尔市德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心科学园研究部表观遗传学和分子致癌系，邮编78957。
^三美国德克萨斯州史密斯维尔市德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心科学园研究部表观遗传学和分子致癌系，邮编：78957；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心UT健康生物医学研究生院，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
⁴德克萨斯大学西南医学中心生理学系，美国德克萨斯州达拉斯75390。
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⁶德克萨斯大学奥斯汀分校ICMB蛋白质组学设施，美国德克萨斯州奥斯汀78712。
⁷结构生物信息学实验室，生物系统动力学研究中心，RIKEN，1-7-22 Suehiro，Tsurumi，Yokohama，Kanagawa 230-0045，Japan。
⁸美国德克萨斯州休斯顿市麦戈文医学院德克萨斯大学休斯顿健康科学中心内科。
⁹美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学分子生理学和生物物理系，邮编：05405。
¹⁰美国德克萨斯州史密斯维尔市德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心科学园研究部表观遗传学和分子致癌系，邮编78957。电子地址：xshen@mdanderson.org。
¹¹美国得克萨斯州泰勒市得克萨斯大学健康科学中心细胞和分子生物学系75708电子地址：pkapoo02@amgen.com。

PMID： 32997990
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摘要

由于缺乏分子机制方面的知识，核肌动蛋白一直是难以捉摸的。从含肌动蛋白的染色质重塑复合物中，我们在进化上保守的肌动蛋白R256me1残基上发现了精氨酸单甲基化标记。酵母中的肌动蛋白R256突变影响核功能并导致人类疾病。有趣的是，我们发现，在酵母、小鼠和人类细胞中，肌动蛋白R256me1特异性抗体优先染色细胞核肌动蛋白，而不是细胞质肌动蛋白。我们还发现，肌动蛋白R256me1在HEK293细胞中受蛋白精氨酸甲基转移酶-5（PRMT5）调节。肌动蛋白R256me1标记的全基因组调查为与转录相关的核肌动蛋白提供了一个景观。此外，基因表达和蛋白质相互作用研究揭示了肌动蛋白R256me1和活性转录之间的广泛相关性。肌动蛋白R256me1标记的发现表明了通过翻译后修饰（PTM）区分核肌动蛋白和细胞质肌动蛋白的基本机制，并可能暗示肌动蛋白PTM标记在转录和人类疾病中的作用。

关键词：INO80；PRMT5；TAAD；肌动蛋白；肌动蛋白PTM；精氨酸单甲基化；核肌动蛋白；转录。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明B.F.P.在Piconic，LLC拥有财务利益，该公司使用本研究中实施的ChIP-exo技术，并可能从本研究结果中受益。

数字

图1。 — **图1.从酵母INO80复合物中鉴定肌动蛋白R256me1**
（A）使用3–10 pH固定化pH梯度（IPG）条带的INO80复合物进行2D凝胶分析，这些复合物用0.5 M KCl缓冲液从未处理（左侧面板）或MMS处理（右侧面板）的BY4733菌株中纯化。用深紫色染色的凝胶显示了INO80复合物的肌动蛋白亚基，显示出多个斑点。（B）第1步，银染后INO80复合物的SDS-PAGE分析（左侧面板），显示凝胶切片的肌动蛋白带，并使用LC-MS/MS进行质谱分析（右侧面板）。第2步，通过质谱分析鉴定针对特定肌动蛋白PTM的抗体，然后，通过使用单独的肌动蛋白PTM抗体，对INO80复合体（Nu-actin）中纯化的细胞质肌动蛋白（Cy-actin）和核肌动蛋白进行western blot分析，如上图所示，如右图所示。所提供的数据是具有类似结果的三个独立生物重复序列的代表。另请参见表S1。

图2。 — **图2.肌动蛋白R256me1抗体的验证和肌动蛋白R256残留物的功能研究**
（A）顶部面板，纯化酵母胞质肌动蛋白（Act1）和INO80复合体银染后的SDS-PAGE分析，如顶部所示；和底部两个面板，使用所示抗体对类似凝胶进行western blot分析。。（B）使用肌动蛋白（C4）和肌动蛋白R256me1抗体进行肽竞争分析后，对含有INO80复合物的纯化细胞质肌动蛋白和核肌动蛋白进行Western blot分析。。（C和D）顶部面板显示纯化酵母INO80、ΔN INO80，SWR1和NuA4复合物银染后的SDS-PAGE分析，如凝胶顶部所示；和下图，使用所示抗体对类似凝胶进行的蛋白质印迹分析。。（E）顶部面板，使用肌动蛋白（C4）抗体对WT和R256C酵母菌株的细胞核和胞质级分的相等蛋白质含量的蛋白质印迹分析；底部面板，银色凝胶提取物的总蛋白含量作为负荷控制。。（F）肌动蛋白突变体的表型分析*行为1-2*（A58T），*活动1-108*（R256A E259A），*行为1-101*（D363A E364A），*行动1:R256C*、和*行动1:R256K*在YEPD和HU（100 mM）板上，温度为30°C。所提供的数据是具有类似结果的三个生物重复的代表。

图3。 — **图3肌动蛋白R256me1标记是受PRMT5监管的保守核肌动蛋白标记**
（A）不同物种肌动蛋白同源物的氨基酸序列比对显示R256残基及其周围序列的高度保守性。（B和C）全细胞提取物、纯化细胞质肌动蛋白、含核肌动蛋白的INO80复合物的Western blot分析，如图所示，使用肌动蛋白R256me1抗体、肌动蛋白（C4）（负荷控制）和组蛋白H3Ac（核分数标记）对NIH 3T3细胞的细胞溶质和核部分进行检测。（D） NIH 3T3细胞的免疫荧光共聚焦图像，用肌动蛋白（C4）和肌动蛋白R256me1抗体染色，显示核肌动蛋白优先于细胞质肌动蛋白的肌动蛋白染色。DAPI染色细胞核。比例尺：50μm。（E） FLAG标记后HEK293细胞hINO80复合物的Western blot分析*hIno80型*如图所示，在基因组中使用抗体。（F和G）使用肌动蛋白（C4）（负荷控制）抗体和肌动蛋白R256me1抗体（F）对转染siRNA的HEK293细胞的全细胞提取物进行蛋白质印迹分析，以对抗顶部提到的单个PRMT。结果表明，与添加PRMT5抑制剂（CMP5）后使用所示抗体（G）敲除其他已知PRMT相比，PRMT5敲除对肌动蛋白R256me1水平的影响显著。（H）之后的Western blot分析*在体外*使用纯化的重组PRMT5和兔肌肉肌动蛋白（未甲基化肌动蛋白底物），使用右侧所示抗体进行甲基化检测。肌动蛋白（C4）是一种负荷控制，组蛋白H4甲基化通过PRMT5作为阳性对照。（一） FLAG标记后HEK293细胞hINO80复合物的Western blot分析*hIno80型*如图所示，在基因组中使用抗体。所提供的数据是具有类似结果的三个独立生物重复序列的代表。

图4。 — **图4酵母中肌动蛋白R256me1的基因组分布**
（A）作为SAGA调节基因的一个例子，未移位的ChIP-exo标记5′在CCW12（YLR110C）基因的正向和反向链上的平滑分布。免疫球蛋白G（IgG）对照显示为灰色，肌动蛋白R256me1显示为品红色，RNA Pol II显示为黑色。（B）热图显示肌动蛋白R256me1、IgG对照和RNA Pol II ChIP exo的标签5′端（在3′方向上移动6 bp，然后去除链信息），通过转录起始点和终点的中点（TSS-TES）排列，分为核糖体蛋白（RP）基因、SAGA、TFIID、编码基因和SUTs、CUTs、XUTs、tRNA，和snoRNA非编码基因，并按基因长度分类。（C）肌动蛋白R256me1（洋红色痕迹）和H2B（红色填充）移位标记5′端在RP、SAGA和TFIID基因+1核小体二联体周围的复合分布（后基因分析），定向使转录方向向右。每个面板中的y轴都从0到1进行了缩放，因此无法在面板之间比较数量级别。（D） TSS和TES周围肌动蛋白R256me1（洋红色）、IgG对照（灰色）和RNA Pol II（黑色）移位标记5′端的复合分布。浅蓝色、绿色和黄色方框分别大致描绘了转录起始、延伸和终止区域。（E）肌动蛋白R256me1（洋红色）、IgG控制（灰色）和RNA Pol II（黑色）移位标记5′端在tRNA基因TSS周围的复合分布，定向使转录方向向右。tRNA的平均长度由黄色填充区域表示。（F） TSS和TES周围Swr1（紫色）、Ino80（蓝色）、actin R256me1（洋红色）和Swc子模块（不同绿色阴影下的Swc5、Swc4和Swc7）标记5′端的复合分布。每条记录道在y轴上分别缩放并垂直移位，以获得更好的可视化效果。所提供的数据是三个生物重复的代表。

图5。 — **图5酵母肌动蛋白R256C突变体的基因表达谱**
（A）利用基因本体（GO）中编译的模块进行基因集富集分析（GSEA）。条形图仅表示标准化富集分数（NES>2.0）和错误发现率（FDR）q值<5%的基因集。蓝色条表示DNA修复过程中涉及的基因集。（B）富集分数图和热图说明了WT和肌动蛋白R256C突变细胞中DNA依赖性DNA复制中路径相关基因的表达。（C）条形图显示了差异表达基因中高表达基因百分比的统计分析，以及肌动蛋白R256C突变体中上调或下调基因的统计分析。（D）饼图显示SAGA调节基因或TFIID调节基因亚类中肌动蛋白R256C突变细胞的基因表达变化。所提供的数据是WT和肌动蛋白R256C突变酵母菌株的三个生物重复的代表性。

图6。 — **图6酵母肌动蛋白R256me1后肌动蛋白构象的变化：100-ns MD模拟分析**
（A）晶体结构*酿酒酵母*肌动蛋白（PDB代码：1YAG）与人凝胶蛋白片段1复合物中测定。肌动蛋白子域（SD1-4）被注释，结合的ATP被显示在原子色的棒子中。R256通过添加甲基进行改性，呈现为紫红色的原子色球和棒。（B）未甲基化肌动蛋白和R256me1肌动蛋白单体骨架原子的根平方偏差（RMSD）的分布计算超过100 ns。与未甲基化肌动蛋白单体相比，R256me1导致更高的RMSD。（C）未甲基化肌动蛋白和R256me1肌动蛋白残基的原子涨落计算为骨架原子的RMSF。这些动力学大多来自DNA酶I环中较高的RMSF（残基35-53）。（D）未甲基化肌动蛋白和R256me1肌动蛋白单体的亚结构域SD2和SD4之间的距离分布（分裂距离）计算超过100 ns。结果表明，与未甲基化肌动蛋白单体相比，R256me1肌动蛋白具有开放构象。绿色虚线表示*酿酒酵母*肌动蛋白晶体结构（PDB代码：1YAG）。（E）从非甲基化肌动蛋白（左）和（B）R256me1肌动蛋白的100ns MD轨迹获得的第一主模式的矢量场表示。色带的颜色表示从较低（蓝色）到较高（红色）的流动性。与非甲基化肌动蛋白相比，在R256me1肌动蛋白中观察到的SD2和SD4亚结构域残基运动相对较少，表明平衡向开放形式转变。另请参见图S6和STAR方法。

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