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.2020年11月；44(5):2152-2164.
doi:10.3892/或.2020.7757。 Epub 2020年9月7日。

检查点激酶-1抑制和足叶乙甙通过破坏同源重组DNA损伤修复对慢性粒细胞白血病细胞系K562表现出强大的协同抗癌作用

卓一凡 1, 罗华成 2, 周杰（音译） 1, 王方策 1, 张文军（Wenjun Zhang） 1, 王健（Jian Wang） 三, 朔丽 4, 钱来 5, 徐月双 6, 王光明 1, 梁爱斌 1, 徐军（Jun Xu） 三
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通过抑制同源重组DNA损伤修复，检查点激酶‑1抑制剂和足叶乙甙对慢性粒细胞白血病K562细胞具有较强的协同抗癌作用

卓一凡等人。 及国际医学权威期刊. 2020年11月.

摘要

白血病是一种恶性血液病，由于化疗耐药，治疗效果较差。越来越多的证据证实，癌细胞DNA损伤修复能力的提高是获得性化疗耐药的主要机制。因此，联合化疗和DNA损伤修复途径抑制剂可能是治疗白血病的理想策略。检查点激酶1（CHK1）是DNA损伤反应（DDR）的重要组成部分，参与G2/M DNA损伤检查点。在本研究中，我们通过CCK‑8和彗星实验的结果证明，shRNA‑介导的CHK1沉默抑制了慢性粒细胞白血病（CML）细胞株K562的细胞增殖，并增强了足叶乙甙（VP16）的细胞毒作用。结果表明，shRNA诱导的CHK1沉默可以通过降低乳腺癌易感基因1（BRCA1）的表达来覆盖G2/M阻滞并损害同源重组（HR）修复。细胞没有时间，因此修复损伤的能力有限，因此在CHK1下调后对化疗更敏感。其次，我们测试了VP16与CCT245737（一种口服生物可利用的CHK1抑制剂）联合的治疗效果，并在K562细胞中观察到了强大的协同抗癌作用。此外，我们发现CCT245737可显著预防VP16急性暴露引起的G2/M期阻滞。有趣的是，CCT245737同时抑制了HR修复途径中最重要的成分BRCA1和Rad51。总之，这些结果表明CHK1可能是治疗CML的理想靶点，CCT245737应被视为候选药物。

关键词：CHK1；CCT245737；DNA损伤反应；足叶乙甙；慢性粒细胞白血病。

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数字

图1。
图1。
CHK1在K562细胞中表达较高。（A） 用qPCR检测KCL22和K562细胞中CHK1 mRNA水平相对于β-actin（负荷对照）水平，以CAM-191细胞作为对照组，以虚线表示。（B） KCL22和K562细胞中CHK1蛋白水平的Western blot分析。（C） 基于对KCL22和K562细胞之间B（***P<0.001）条带强度的密度分析，CHK1表达的相对定量标准化为GAPDH表达。CHK1，检查点激酶1。
图2。
图2。
shRNA-介导的CHK1敲除有效抑制细胞增殖。（A） qPCR检测感染三种不同慢病毒（shVector、shNC和shKD）的K562细胞中CHK1 mRNA水平与β-actin（负载控制）水平的关系。（B） Western blotting证实shCHK1（shKD）能有效抑制K562细胞中CHK1蛋白的表达。（C） 在Chk1敲除（shKD）后，通过CCK-8分析检测不同天数的细胞活力。测量OD450 nm值并绘制时间曲线（*P<0.05，**P<0.01）。检查点激酶1。shKD、Chk1-敲除细胞。
图3。
图3。
CHK1敲除增强VP16在K562细胞中的细胞毒性。（A） DSB标记γH2AX和总H2AX表达的Western blot分析。（B） 使用在正常条件下（CON）或用DMSO或VP16处理后用shVector、shNC或shCHK1（shKD）转导的细胞进行碱性彗星试验，以评估DNA损伤水平。shRNA沉默CHK1可增强VP16对DNA损伤的诱导作用。（C） B中所述碱性彗星试验中尾部力矩的图示（***P<0.001）。（D） 细胞凋亡标记物裂解PARP（c-PARP）的Western blot分析。shRNA-介导的CHK1抑制显著增加VP16诱导的细胞凋亡。（E） 在正常条件下（CON）和DMSO或VP16处理后，对感染三种不同慢病毒的K562细胞进行集落形成分析。（F） E中描述的菌落数量的图形表示（**P<0.01，***P<0.001）。NS，不显著；CHK1，检测点激酶1；DSB，双绞线断裂；VP16，依托泊苷。
图4。
图4。
shRNA-介导的CHK1击倒降低G2/K562细胞的M阻滞与HR修复。（A） 用二甲基亚砜（对照）或VP16处理后，检测shNC或shCHK1（shKD）转导的K562细胞的细胞周期分布。（B） G的统计分析2/M期百分比（%）如A所示（*P<0.05，**P<0.01）。（C） G蛋白的Western blot分析2/在正常条件下和DMSO或VP16存在下，感染携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）慢病毒的K562细胞中的M阻遏标记物pS216CDC25c、pY15CDK1和总CDC25c和CDK1。（D） 在正常条件下和DMSO或VP16存在下，对感染携带shVector、shNC或shCHK1（shKD）慢病毒的K562细胞中有丝分裂标记pS10-H3和总H3进行Western blot分析。（E） 在正常条件下和用DMSO或VP16处理后，对shVector-、shNC-或shCHK1-转导（shKD）K562细胞中NHEJ通路相关蛋白Ku70、Ku80和连接酶4（Lig4）进行Western blot分析。（F） 通过密度分析显示E中Ku70（a）、Ku80（b）和Lig4（c）表达的相对定量；靶带强度归一化为GAPDH的强度。（G） 在正常条件下和用DMSO或VP16处理后，对shVector-、shNC-或shCHK1-转导（shKD）K562细胞中HR通路相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和Rad51进行Western blot分析。（H） 通过密度分析对G中显示的BRCA1（a）、Rad50（b）、MRE11（c）和Rad51（d）表达进行相对定量；带强度归一化为GAPDH（*P<0.05）。NS，不显著。CHK1，检测点激酶1；HR，同源重组；VP16，依托泊苷。
图5。
图5。
CCT245737对VP16诱导的K562细胞CHK1和DNA损伤生物标记物水平变化的影响的表征。（A） 增加CCT245737浓度处理24小时后K562细胞CHK1总表达的Western blot分析（B）通过密度分析显示A中CHK1表达的相对定量；带强度归一化为GAPDH（*P<0.05）。（C） 用VP16（5µM）、CCT245737（5μM）或VP16和增加CCT24573浓度的组合处理K562细胞进行Western blot分析。CHK1在Ser296的自磷酸化和Ser317和Ser345的磷酸化被用作CHK1活性的生物标记，γH2AX被用作DNA损伤的生物标记。NS，不显著。CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。
图6。
图6。
CCT245737使K562细胞对VP16敏感。（A） 增加CCT245737浓度治疗24小时后K562细胞存活率%的图形表示（B）使用指定药物治疗24小时之后，对K562电池进行Chou-Talalay分析后，（A）存活率%和（B）Fa-CI的图形表示伊马替尼处理的K562（K562-IM）细胞在用指定药物处理24小时后的Chou-Talalay分析后的Fa CI。（D）CAM191细胞在用指定药物处理24小时后的（a）生存率%和（b）Chou-Talalay分析后的Fa CI的图示。（E）进行碱性彗星试验，以评估用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时的K562细胞的DNA损伤程度。（G） 用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理K562细胞24小时后，细胞凋亡标记物裂解PARP的Western blot分析。VP16与CCT24573结合可增加c-PARP水平。NS，不显著；VP16，依托泊苷；c-PARP，裂解聚（ADP-核糖）聚合酶。
图7。
图7。
CCT245737废除G2/M阻滞并降低K562细胞的HR修复能力。（A） CCT245737（500 nM，24小时）对急性VP16（5µM，1.5小时）处理的K562细胞的细胞周期阻滞的影响。（B） G的统计分析2/A中描述的M相百分比（%）（**P<0.01，***P<0.001）。（C） G蛋白的Western blot分析2/用CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时的K562细胞中的M阻滞标记pS216CDC25c、pY15CDK1和总CDC25c和CDK1CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理K562细胞24小时后NHEJ通路相关蛋白Ku70、Ku80和连接酶4（Lig4）的Western blot分析。（G） CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）处理24小时后K562细胞HR通路相关蛋白BRCA1、Rad50、MRE11和Rad51的Western blot分析（I）暴露于CCT245737（500 nM）和/或VP16（5µM）24 h后，伊马替尼处理的K562细胞中BRCA1和Rad51蛋白表达的Western blot分析。NS，不显著；HR，同源重组；CHK1，检测点激酶1；VP16，依托泊苷。
图8。
图8。
CHK1介导的G调节的示意图模型2/M细胞周期检查点和HR修复途径。BRCA1，乳腺癌基因易感性1；BARD1、BRCA1-相关环域蛋白1；CDC25c，细胞分裂周期蛋白25同源物C；CDK1，细胞周期蛋白依赖性激酶1；CHK1，检测点激酶1；Lig4，连接酶4。
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    1. Kaleem B，Shahab S，Ahmed N，Shamsi TS。慢性粒细胞白血病-突变的预后价值。亚洲太平洋癌症杂志。2015;16:7415–7423. doi:10.7314/APJCP.2015.16.17.7415。-内政部-公共医学
    1. Valent P、Hadzijusuffovic E、Schernthaner GH、Wolf D、Rea D、le Coutre P。使用BCR/ABL1激酶抑制剂治疗的CML患者的血管安全问题。鲜血。2015;125:901–906。doi:10.1182/bloud-2014-09-594432。-内政部-公共医学
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    1. Dillon MT、Good JS、Harrington KJ。选择性靶向G2/M细胞周期检查点以提高放射治疗的治疗指数。《临床肿瘤》（R Coll Radiol）2014；26:257–265. doi:10.1016/j.clon.2014.01.009。-内政部-公共医学

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