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。2020年6月；10(6):987-1003.
doi:10.1016/j.apsb.2020.02.015。 Epub 2020年3月5日。

TIMP1通过与CD63/整合素相互作用保护血脑屏障β1复合和调节下游FAK/RhoA信号

荆术汤 1, 康玉英（Yuying Kang） 1, 黄龙剑 1, 雷武（Lei Wu） 1, 英鹏 1
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TIMP1通过与CD63/整合素相互作用保护血脑屏障β1复合物并调节下游FAK/RhoA信号传导

荆术汤等。 药物学报B。 2020年6月。

摘要

血脑屏障（BBB）破坏和相关的微血管通透性增高是包括创伤性脑损伤（TBI）在内的几种神经系统疾病的特征。然而，目前还没有可行的治疗策略来挽救BBB功能。金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1）被认为对血管完整性有益，但TIMP1功能的分子机制尚不清楚。这里，我们报告TIMP1对神经保护功能起保护作用通过改善实验性TBI小鼠的BBB破坏。在暴露于缺氧和炎症损伤的人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中，重组TIMP1（rTIMP1）治疗保持连接蛋白的完整性和跨内皮细胞的紧密性。TIMP1在机械上与CD63/整合素相互作用β1复合并激活下游FAK信号，导致RhoA激活减弱和F-actin解聚，以稳定内皮细胞结构。值得注意的是，这些作用取决于CD63/整合素β1复合物，而不是MMP抑制功能。总之，我们的结果确定了TIMP1在调节内皮屏障完整性方面的一种新的MMP依赖性功能。针对TIMP1及其下游信号的治疗干预可能有助于保护脑损伤和神经疾病后的BBB功能。

关键词：AJ，粘连连接；血脑屏障；血脑屏障；CD63；中枢神经系统；内皮细胞；脑微血管内皮细胞；整合素β1；连接蛋白；基质金属蛋白酶-9；创伤性脑损伤；TIMP1，金属蛋白酶组织抑制剂-1；TJ，紧密连接；金属蛋白酶组织抑制剂-1。

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图形摘要
图1
图1
重组TIMP1（rTIMP1）治疗对创伤性脑损伤（TBI）后神经预后的影响。（A） 通过SDS-PAGE和Western blots分析真核细胞（293T）中表达的重组TIMP1蛋白。（B） –（E）每天通过尾静脉给TBI小鼠注射rTIMP1（30、90和270μg/kg）或PBS。在TBI后24小时和72小时评估运动功能(n个=每组13–15人）。（B） 从加速的Rota棒上落下的延迟。（C） 横穿梁所用的平均时间。（D） 束流行走测试中后肢运动得分。（E） 横梁行走测试中后肢脚部故障的数量。数据表示为平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01).
图2
图2
rTIMP1治疗减弱TBI小鼠血脑屏障（BBB）的通透性和结合蛋白（JPs）的丢失。（A） 创伤性脑损伤后3天，假损伤组、TBI组用载体治疗或TBI组经静脉注射rTIMP1（30、90和270μg/kg）治疗的脑组织的代表性图像和相应的冠状切片。蓝色区域表示埃文斯蓝染料外渗。（B） 量化指定治疗组小鼠同侧大脑半球组织中伊文思蓝染料的含量(n个=每组11–12人）。（C） Western blot分析和定量测定TBI后72 h指定治疗组同侧大脑半球总裂解物中的ZO-1、VE-cadherin、clodin和claudin-5。使用GAPDH作为负荷对照。n个=每组5人。（D） Western blot分析和定量测定TBI后72 h指定治疗组同侧大脑半球膜碎片中的ZO-1、VE-cadherin、clodin和claudin-5。以Na/K-ATP酶作为负荷对照。数据表示为平均值±SEM，n个=每组5人。（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01).
图3
图3
TIMP1公司敲除诱导内皮细胞JP的跨内皮屏障渗漏和降解。（A） 的插图在体外用于评估屏障功能的BBB模型。将HBMECs单层接种在细胞培养插入物的顶膜上，然后测量渗入白蛋白的40kDa FITC-右旋糖酐浓度，以确定细胞旁通透性（左）或跨内皮电阻（TEER），以评估TJ完整性（右）。（B） 转染对照或抗hTIMP1 siRNA的HBMECs进行跨孔渗透性分析。数据表示六个独立实验的平均值±SEM(**P（P） < 0.01). （C） 对用对照或针对hTIMP1的siRNA转染的HBMEC进行TEER测定。数据表示六个独立实验的平均值±SEM(**P（P） < 0.01). （D） 用siRNA处理的HBMECs的总细胞裂解物中指示蛋白的蛋白质印迹分析和定量。GAPDH用作负载对照。数据代表三个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （E） Western blot分析和量化经siRNA处理的HBMEC膜片段上的指示蛋白。以Na/K ATP酶作为负荷控制。数据表示三个独立实验的平均值±SEM(**P（P） < 0.01). （F） 用抗VE-cadherin（绿色）、claudin-5（绿色）和cloddin（绿）或claudin5（绿色）抗体进行免疫荧光（IF）染色，并用Hoechst33342（蓝色）进行核标记，分析siRNA处理的HBMEC中结合蛋白的分布。比例尺，10μm。
图4
图4
TIMP1减轻缺氧加IL-1诱导的BBB损伤β侮辱。以指定剂量用PBS或rTIMP1处理的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β持续24小时。（A） 对来自指定治疗组的HBMEC进行跨孔渗透性分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （B） 对来自指定治疗组的HBMEC进行TEER分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （C） Western blot分析和量化所示治疗组的总细胞裂解液中的ZO-1、闭塞素、克劳丁-5和VE-cadherin蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。数据代表三个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P）<0.05**P（P） < 0.01). （D） Western blot分析和量化所示治疗组膜碎片上的ZO-1、闭塞素、克劳丁-5和VE-cadherin蛋白水平。以Na/K ATP酶作为负荷控制。数据代表三个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01).
图5
图5
TIMP1以MMP无关的方式保护血脑屏障免受损伤。（A） 通过SDS-PAGE和Western blots分析真核细胞（293T）中表达的重组rAla-TIMP1蛋白。（B） –（F）用1μg/mL rTIMP1或rAla-TIMP1处理的HBMEC受到缺氧加上20 ng/mL IL-1β持续24小时。（B） 对来自指定治疗组的HBMEC进行跨孔渗透性分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （C） 对来自指定治疗组的HBMEC进行TEER分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （D） Western blot分析和细胞总裂解物中指示蛋白的定量（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （E） Western blot分析和量化膜片段中的指示蛋白质。数据代表三个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （F） 细胞还接受VE-cadherin、claudin-5、clodin和ZO-1的IF染色。比例尺，10μm。
图6
图6
TIMP1通过CD63和整合素调节BBB完整性β1信号。（A） 提取HBMEC的总细胞裂解物，并使用TIMP1抗体进行IP分析。对整合素进行蛋白质印迹β1、CD63或TIMP1。（B） 提取HBMEC的总细胞裂解物，并对其进行整合素处理β1或CD63 IP分析。随后进行整合素的Western blot分析β1、CD63或TIMP1。（C） –（H）HBMECs转染对照或siRNA靶向CD63或整合素β1用rTIMP1处理，然后对指定的组进行缺氧加20ng/mL IL-1β持续24小时。（C） 对来自指定治疗组的HBMEC进行跨孔渗透性分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （D） 对来自指定治疗组的HBMEC进行TEER分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著**P（P） < 0.01). （E） Western blot分析和细胞总裂解物中指示蛋白的定量（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （F） Western blot分析和量化膜片段中的指示蛋白质。数据代表三个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （G） 细胞还接受VE-cadherin、claudin-5、clodin和ZO-1的IF染色。比例尺，10μm。
图7
图7
TIMP1激活整合素-FAK信号调节F-actin重排。（A） 以1μg/mL PBS或rTIMP1处理的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β持续24小时。细胞裂解物中磷酸化FAK水平的Western blot分析和量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM(*P（P） < 0.05). （B） 转染pcDNA3.1或TIMP1的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β持续24小时。细胞裂解物中磷酸化FAK水平的Western blot分析和量化。数据代表三个独立实验的平均值±SEM(*P（P） < 0.05). （C） –（F）用PBS、20μmol/L Y15和1μg/mL TIMP1或1μg/mL TIMP1单独处理的HBMEC受到缺氧加上20 ng/mL IL-1β持续24小时。进行Transwell渗透率（C）和TEER（D）分析。数据代表六个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). Western blot分析和量化来自总细胞裂解物（E）和膜片段（F）的指示蛋白质。数据代表五个独立实验的平均值±SEM（ns，不显著*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （G） 用PBS或rTIMP1以1μG/mL处理的HBMEC受到缺氧加上20 ng/mL IL-1β持续24小时。细胞裂解物中RhoA-GTP水平的Western blot分析和量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM(*P（P） < 0.05). （H） 转染pcDNA3.1或TIMP1的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β持续24小时。细胞裂解物中RhoA-GTP水平的Western blot分析和量化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM(*P（P） < 0.05). （一） 以1μg/mL PBS或rTIMP1处理的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β24 h后进行F-actin IF染色。比例尺，25μm。（J） 转染pcDNA3.1或TIMP1的HBMEC受到缺氧和20 ng/mL IL-1的影响β24 h后进行F-actin IF染色。比例尺，25μm。
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参考文献

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