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。2020年4月24日；11(4):284.
doi:10.1038/s41419-020-2447-7。

CircGCN1L1通过靶向miR-330-3p和TNF-α促进TMJ骨关节炎滑膜细胞增殖和软骨细胞凋亡

朱惠民 1, 胡一辉 1, 王传东 2, 张晓玲 三, 何冬梅 4
附属机构

CircGCN1L1通过靶向miR-330-3p和TNF-α促进TMJ骨关节炎滑膜细胞增殖和软骨细胞凋亡

朱惠民等。 细胞死亡病。 。

摘要

环状RNA（circRNAs）的改变表达已在各种人类疾病中被发现。在本研究中，我们研究了circRNAs是否作为竞争性内源性RNAs来调节颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）的病理过程。进行了信使核糖核酸高通量测序（RNA-seq），以检测从人类分离的TMJOA和对照滑膜组织中circRNA的表达。在体内外验证了滑膜细胞中差异上调的circGCN1L1（hsa_circ_0000448）。在这里，我们通过生物信息学预测、荧光素酶报告分析和荧光原位杂交证明了circGCN1L1与miR-330-3p和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）之间的相互作用。TNF-α刺激的滑膜细胞mRNA表达谱显示，TNF-β上调了circGCN1L1和p65的表达。此外，miR-330-3p与TNF-α分泌呈负相关。此外，我们发现miR-330-3p直接靶向TNF并抑制基质降解酶（MMP3、MMP13和ADAMTS4）的产生。力学研究表明，TMJOA滑膜组织和细胞中的circGCN1L1可能与髁突软骨细胞凋亡和滑膜细胞增生有关。此外，关节内注射shcircGCN1L1可减轻大鼠模型中TMJOA的进展。总之，我们阐明了一种新的circRNA的重要作用，即circGCN1L1，它通过miR-330-3p和TNF-α基因诱导TMJ滑膜细胞炎症并降低细胞外基质（ECM）的合成代谢。这种circRNA可能代表了一种潜在的有效治疗策略，可以在早期阶段对抗TMJOA进展。

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数字

图1
图1。CircGCN1L1在TMJ滑膜组织和细胞中的表达和定位。
一TMJOA和对照组患者的典型MRI图像。b条TMJOA和对照组患者的年龄、Wilkes分期、MIO和VAS疼痛评分。N个 = 40名（每组20名不同的患者）*第页 < 0.05.c（c）TMJOA和对照滑膜样品之间所有差异表达的circRNAs的热图。N个 = 10个（每组五个不同的样本）。d日从circBase和UCSC基因组浏览器获得的circGCN1L1序列与GCN1L1mRNA序列的比较。e（电子）对照患者滑膜细胞中RNA FISH的图像。CircGCN1L1探针用Cy3标记。细胞核用DAPI染色。比例尺，20 微米。U6用作核RNA的内部对照，而18s用作细胞质RNA的对照。N个 = 3（三个不同的样品）。数据以平均值表示 ± S.D.双尾t吨-测试(b条)已执行。MRI磁共振成像，TMJOA颞下颌关节骨关节炎，MIO最大口腔切牙开口，VAS视觉模拟量表，FISH荧光原位杂交，DAPI盐酸盐。
图2
图2。circGCN1L1结合miRNA的预测和验证。
一Circular RNA Interactome、StarBase和RegRNA2.0数据库用于预测circGCN1L1及其潜在结合位点的相互作用miRNA。b条RT-qPCR检测滑膜组织和滑膜细胞中circGCN1L1和miR-330-3p的表达。N个 = 15个（每组五个不同的样本，用于三个独立实验）*第页 < 0.05.c（c）用circGCN1L1报告子或circGCN 1L1 MT报告子和miR-330-3p或NC转染HEK-293T细胞，然后检测荧光素酶活性。相对萤光素酶活性显示在直方图中。N个 = 3（三个重复）*第页 < 0.05.d日对照患者的滑膜细胞用50 nM circGCN1L1或shcircGCN1 L1质粒。48岁之后 h、 通过RT-qPCR检测circGCN1L1和TNF-α的表达水平，并将其归一化为β-actin水平。通过RT-qPCR检测miR-330-3p的表达，并将其归一化为U6表达。N个 = 6（两个不同的样品用于三个独立的实验）*第页 < 0.05.e（电子）对照患者的滑膜细胞转染50 nM circGCN1L1质粒和/或miR-330-3p模拟物。48岁之后 h、 通过RT-qPCR检测circGCN1L1、TNF-α、MMP3和MMP13的表达水平，并将其归一化为β-actin水平。miR-330-3p的表达归一化为U6的表达。N个 = 6个（三个重复的两个不同样品）*第页 < 0.05. 数据以平均值表示 ± S.D.双尾t吨-测试(b条,d日)和带Bonferroni检验的单向方差分析(c（c）,e（电子）)已执行。TNF肿瘤坏死因子，NC正常对照，RT-qPCR实时定量聚合酶链反应。
图3
图3。环GCN1L1、miR-330-3p和TNF-α在TMJ滑膜组织和细胞中的表达及其相互关系。
一TNF-α及其受体（TNFR1和TNFR2）在人TMJOA滑膜组织和对照组织中的表达。N个 = 15个（每组五个不同的样本，用于三个独立实验）*第页 < 0.05.b条TargetScan、miRanda和StarBase数据库用于预测靶向TNF的可能miRNAs。c（c）用含有MT或WT TNF 3′-UTR的miR-330-3p或NC和荧光素酶报告体转染HEK-293T细胞。N个 = 3（三个重复一个样品）*第页 < 0.05.d日将miR-330-3p模拟物或抑制剂以不同浓度（10、20、50和100）转染对照患者的滑膜细胞 nM）。N个 = 6（两个不同的样品用于三个独立的实验）*第页 < 0.05.e（电子）用不同剂量（0、5、10和20μg/l）的TNF-α刺激不同时间段（12、24和48 h） 用RT-qPCR检测并归一化为β-肌动蛋白水平。miR-330-3p的表达归一化为U6的表达。N个 = 6（两个不同的样品用于三个独立的实验）*第页 < 0.05.（f）在不同的时间点（1、2、4、8、16、32和48）收集转染miR-330-3p模拟物或抑制剂的对照患者滑膜细胞的上清液 h） 用ELISA法检测TNF-α蛋白水平。N个 = 6（两个不同的样品用于三个独立的实验）*第页 < 0.05. 数据以平均值表示 ± S.D.双尾t吨-测试(一)和带Bonferroni检验的单向方差分析(c（c）–（f）)已执行。TNF肿瘤坏死因子、TNFR1肿瘤坏死因子受体1型、TNFR2肿瘤坏死因子接收器2型、RT-qPCR实时定量聚合酶链反应、NC正常对照、MT突变、WT宽型、ELISA酶联免疫吸附试验。
图4
图4。CircGCN1L1与miR-330-3p相互作用，参与滑膜细胞增殖和软骨细胞凋亡的调节。
一,b条用circGCN1L1质粒或miR-330-3p抑制剂转染来自对照患者的人滑膜细胞。使用定量FACS分析检测G1、S或G2期细胞的比例。N个 = 6（两个不同的样品用于三个独立的实验）*第页 < 0.05.c（c）对照患者和共同培养软骨细胞的单个培养滑膜细胞的Edu细胞增殖试验。根据转染情况将滑膜细胞分为不同的组（circGCN1L1、circGCN1 L1对照、shcircGCN 1L1，shcircGC 1L1对照，shcickGCN1L2和miR-330-3p抑制剂，以及空白对照）。Edu标记的增殖细胞（绿色），DAPI标记的细胞核（蓝色）。N个 = 3（一个样本用于三个独立实验）。比例尺，500 微米。d日将来自对照患者的TMJ滑膜细胞转染不同浓度的质粒，然后与髁突软骨细胞共同培养。软骨细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双重染色，FACS定量分析*第页 < 0.05. 数据以平均值表示 ± S.D.单向方差分析与Bonferroni检验(c（c）–（f）)已执行。FACS传真荧光激活细胞分选、PI碘化丙啶、FITC异硫氰酸荧光素、DAPI盐酸盐、Edu 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷、TMJ颞下颌关节。
图5
图5。MiR-330-3p介导人TMJ滑膜细胞中circGCN1L1的功能。
一对照患者的滑膜细胞分别瞬时转染miR-330-3p模拟物、miR-330-3模拟物NC、miR-33-3p抑制剂或miR-330抑制剂NC。48小时后，用WB检测MMP13、MMP3、COL2A1和ADAMTS4的水平。N个 = 4（四个独立实验）。b条将带有/不带有miR-330-3p模拟物的CircGCNL1转染到共同培养的滑膜细胞中。共培养2天后，从下室软骨细胞中提取蛋白质，并进行WB检测MMP13、MMP3、COL2A1、ADAMTS4、TNF-α、p65、Bcl-2、Bax、caspase-3和裂解caspase-3。N个 = 4（四个独立实验）。数据以平均值表示 ± 使用Bonferroni检验进行S.D.单向方差分析。WB western blotting，NC正常对照，MMP基质金属蛋白酶，TNF肿瘤坏死因子，Bcl-2 B细胞淋巴瘤-2，Bax BCL2相关X，COL2A1 II型胶原α1。
图6
图6。抑制TMJOA大鼠模型中circGCN1L1的表达可减缓骨关节炎的进展。
一,b条注射shcircGCN1L或shcircGC N1L1 MT的对照组和闭塞诱导OA大鼠软骨的HE和藏红素-O/快速绿色染色。比例尺，50 微米。根据染色结果进行OARSI评分；N个 = 40只（每组10只）*第页 < 0.05.c（c）,d日注射shcircGCN1L或shcircGCN1L1-MT的对照和闭塞诱导的OA大鼠的IHC染色。比例尺，50 微米。N个 = 40只（每组10只）*第页 < 0.05. 数据以平均值表示 ± 使用Bonferroni检验进行S.D.单向方差分析。HE苏木精-伊红、IHC免疫组织化学、MT突变、OA骨关节炎、OARSI国际骨关节炎研究学会。
图7
图7。工作假设示意图。
滑膜细胞中新的circGCN1L1可能作为miR-330-3p海绵发挥作用，上调TMJOA中TNF-α的表达，减轻体内TMJOA。
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