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。2020年2月7日8:31。
doi:10.3389/fcell.2020.00031。 eCollection 2020。

溶酶体膜蛋白Lamp2通过促进缺血心肌细胞自噬流减轻溶酶体细胞死亡

林翠 1, 赵立平 2, 晶莹叶 1, 雷阳 1, 姚明 1, 徐平江 1, 张琼（音） 1, 杰兹佳 1, 张冬霞 1, 黄月生 1
附属公司

溶酶体膜蛋白Lamp2通过促进缺血心肌细胞自噬流减轻溶酶体细胞死亡

林翠等。 前电池开发生物。 。

摘要

溶酶体膜通透性（LMP）是近年来发现的一种重要的细胞死亡途径。然而，关于LMP与心肌细胞死亡之间相关性的研究很少。溶酶体膜相关蛋白2（Lamp2）是溶酶体细胞膜的重要组成部分，参与自噬和LMP。在本研究中，我们发现Lamp2的蛋白质含量随着氧、葡萄糖和血清剥夺（OGD）治疗而逐渐降低在体外为了进一步阐明其在缺血心肌细胞中的作用，特别是在自噬和LMP方面，我们用携带全长Lamp2的腺病毒感染心肌细胞，以恢复其在细胞中的蛋白水平。我们发现OGD治疗导致LMP的发生和心肌细胞活性的下降，而Lamp2的恢复显著逆转了这一点。Lamp2的外源性表达也通过促进组织蛋白酶B（Cat B）和组织蛋白酶D（Cat D）的运输，显著减轻了OGD处理诱导的自噬流量阻断。通过药物干预和基因调控分别缓解和加剧自噬流量阻断，我们发现缺血损伤引起的自噬通量受损有助于心肌细胞LMP的发生。总之，我们目前的数据表明，Lamp2过表达可以改善自噬流量阻断，可能是通过促进组织蛋白酶的运输，从而赋予心肌细胞对缺血性损伤诱导的溶酶体细胞死亡（LCD）的抵抗力。这些结果可能为缺血性心脏损伤提供新的治疗靶点。

关键词：LMP；灯2；OGD；自噬通量；心肌细胞。

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数字

图1
图1
Lamp2过度表达促进心肌细胞对OGD应激的抵抗。（A）采用Western blotting检测OGD治疗不同时间后Lamp1和Lamp2的水平。（B）免疫印迹定量分析（A）.数据表示平均值±SEM(n个= 5). *P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.01。（C）OGD治疗9小时后Lamp1和Lamp2的典型共焦图像，比例尺，10μm。（D）荧光定量分析（C）平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与对照组相比<0.01。（E）用CCK-8分析测定细胞活力，并将其归一化为对照组。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（F）进行LDH渗漏分析以确定细胞死亡。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。
图2
图2
LMP参与心肌细胞的缺血/缺氧损伤。（A）OGD处理9 h Bar，25μm后吖啶橙染色的代表性图像。（B）图像的定量分析（A）平均值±SEM。n个=5**P（P）与对照组相比<0.01。（C）Gal3免疫荧光检测溶酶体膜损伤。棒材，10μm。（D）Gal3免疫荧光强度定量分析。平均值±SEM。n个= 3. *P（P）与对照组相比，<0.05。（E）OGD处理3、6和9小时后，用洋地黄素溶液（17μg/ml）提取不含溶酶体的细胞质，以检测组织蛋白酶B活性。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与对照组相比<0.01。（F）通过CCK-8分析评估细胞存活率，并将该值归一化为对照组的值。CA074（20μM）和pep A（12.5μg/ml）减轻OGD应激诱导的细胞损伤。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与对照组相比<0.01#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD组相比<0.01。（G）通过LDH渗漏分析确定细胞损伤。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与对照组相比<0.01，##P（P）与OGD组相比<0.01。（H）根据CCK-8分析，Cat D siRNA提高了细胞活力。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且#P（P）与OGD+NC组相比<0.05。（一）采用乳酸脱氢酶渗漏分析评估细胞损伤。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（J）进行Cat D的蛋白质印迹以检测Cat D siRNA的转染效率。
图3
图3
外源性Lamp2过度表达抑制OGD处理的心肌细胞中的LMP。（A、B）典型共焦免疫荧光图像（A）OGD治疗9h后Gal3和Lamp1水平的定量分析（B）.比例尺，10μm。对于定量分析，数据表示为平均值±SEM(n个=3）**P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，P<0.01。（C）不含溶酶体组分的细胞溶质组织蛋白酶B活性检测。平均值±SEM。n个= 3. **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，P<0.01。
图4
图4
Lamp2修复挽救了OGD治疗引起的自噬通量阻断。（A、B）蛋白质印迹（A）和定量分析（B）LC3和SQSTM1对OGD处理3、6和9小时的反应。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与对照组相比<0.01。（C、D）蛋白质印迹（C）和定量分析（D）使用雷帕霉素（200 nM）、3-MA（1 mM）和CQ（20μM）处理LC3和SQSTM1。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与对照组相比<0.01#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD组相比<0.01。（E、F）外源性感染全长Lamp2腺病毒的LC3、SQSTM1和Lamp2的蛋白质印迹（E）以及定量分析的结果（F）平均值±SEM(n个= 3). *P（P）< 0.05, **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（G、H）用雷帕霉素、3-MA或CQ处理心肌细胞，无论是否有Lamp2过度表达，并进行Western blotting以确定LC3和SQSTM1的水平（G）.定量分析（H）这些结果的平均值为±SEM(n个= 3). *P（P）< 0.05, **P（P）与OGD+NC组相比<0.01##P（P）与OGD+Lamp2组相比，<0.01。（一）mCherry-GFP-LC3的典型共焦图像。棒材，10μm。（F）定量分析（J）表示为平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（左）DAL绿色荧光染料检测。比例尺，10μm。（K）定量分析（左）平均值±SEM(n个=3）**P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。
图5
图5
Lamp2的过度表达减轻了OGD治疗诱导的组织蛋白酶转运功能障碍。（A、B）组织蛋白酶和Lamp1双重染色以确定组织蛋白酶D的贩运（A）组织蛋白酶B（B）.比例尺，10μm。（C、D）定量分析（A、B）平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（E、F）Western blotting检测Lamp2过表达的CD-M6PR和Cl-M6PRs的蛋白水平（E）.定量分析（F）表示为平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。
图6
图6
自噬通量阻断是OGD诱导心肌细胞LMP的原因。（A、B）经3-MA（1 mM）或CQ（20μM）OGD治疗后的Gal3免疫染色（A）.定量分析（B）.比例尺，10μm。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与对照组相比<0.01，##P（P）与OGD组相比<0.01。（C）采用3-MA（1 mM）或CQ（20μM）处理的LMP的范围通过细胞溶质组织蛋白酶B的活性测定。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与对照组相比<0.01#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD组相比<0.01。（D）进行CCK-8分析以评估细胞活力。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与对照组相比<0.01，##P（P）与OGD组相比<0.01。（E）通过LDH渗漏实验测定细胞毒性。平均值±SEM(n个=5）**P（P）与对照组相比<0.01，#P（P）< 0.05,##P（P）与OGD组相比<0.01。（F、G）Gal3与ATG5 siRNA的代表性图像（F）.定量分析（G）.比例尺，10μm。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（H）ATG5 siRNA转染后胞浆组织蛋白酶B活性的检测平均值±扫描电镜(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（一）采用CCK-8法检测细胞活力。平均值±SEM(n个= 4). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，#P（P）与OGD+NC组相比，<0.05。（J）通过LDH渗漏实验评估细胞毒性。平均值±SEM(n个= 3). **P（P）与常氧+NC组相比<0.01，并且##P（P）与OGD+NC组相比，<0.01。（K）Western blotting检测ATG5 siRNA的转染效率。
图7
图7
Lamp2保护心肌细胞免受OGD治疗。Lamp2改善受损的自噬流量，从而减轻OGD治疗引起的LMP和心肌细胞死亡的拟议途径示意图。
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