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.2020年7月21日；29（11）：1864-1881。
doi:10.1093/hmg/ddaa014。

导致神经退行性变的DNMT1突变反常地反映在线粒体代谢上

亚历山德拉·马雷斯卡 1, 瓦伦蒂娜·德尔·多托 2, 玛丽安托尼埃塔·卡普里斯托 1, 伊曼纽拉·西莫内利 2, 弗朗西丝卡·塔利亚维尼 1, 卢卡·莫兰迪 2, 瓦伦蒂娜·特罗皮亚诺协奏曲 1, 莱昂纳多·卡波拉利 1, 苏珊·穆罕默德 1, 玛丽娜·罗伯蒂 三, 莱蒂齐亚·斯坎迪菲奥 三, 米尔科·扎法里尼 4, 雅各布·罗西 4, 玛蒂娜·卡佩莱蒂 4, 弗朗西斯科·穆西亚尼 4, 曼纽拉·孔廷 1 2, 罗伯托·里瓦 1 2, 洛科·利古奥里 1 2, 法比奥披萨 1 2, 希亚拉·拉莫吉亚 1 2, 埃琳娜·安特尔米 2, 保拉·洛盖西奥·波洛萨 三, 伊曼纽尔·米格诺特 5, 克劳迪娅·赞纳 4, 朱塞佩·普拉齐 1 2, 瓦莱里奥·卡雷利 1 2
附属机构

导致神经退行性变的DNMT1突变反常地反映在线粒体代谢上

亚历山德拉·马雷斯卡等。 人类分子遗传学. .

摘要

ADCA-DN和HSN-IE是罕见的神经退行性综合征，由DNA甲基转移酶1（DNMT1）基因的复制焦点靶向序列（RFTS）的显性突变引起。这两种表型与线粒体疾病相似，线粒体功能障碍首次在ADCA-DN中观察到。为了探索线粒体的参与，我们研究了DNMT1突变对四名ADCA-DN和两名HSN-IE患者成纤维细胞的影响。我们记录了纯化的DNMT1突变蛋白的活性受损，这导致成纤维细胞中DNMT1数量增加。我们证明DNMT1不位于线粒体内，但与线粒体外膜相关。同时，线粒体DNA没有显示出有意义的CpG甲基化。引人注目的是，我们发现有丝分裂发生和OXPHOS被激活，H2O2显著增加，与ATP含量降低形成鲜明对比。突变细胞的代谢组学分析强调，嘌呤、精氨酸/尿素循环和谷氨酸代谢是与原发性线粒体疾病类似的最稳定的改变途径。最严重的突变表现为能量不足AMPK依赖性传感激活，导致mTORC1抑制。我们认为DNMT1 RFTS突变解除了代谢调节，降低了ATP水平，这是嘌呤分解代谢和尿素循环途径增加的结果。这与自相矛盾的线粒体功能亢进和氧化应激增加有关，可能导致非分裂细胞的神经退化。

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数字

图1
图1
的建模DNMT1（DNMT1）纯化人甲基转移酶活性的突变DNMT1（DNMT1）突变蛋白和DNMT1（DNMT1）在成纤维细胞中表达。（A）和B）人体带状图DNMT1（DNMT1）晶体结构（19）。使用了NP_001124295.1的编号，括号中包含晶体结构编号。RFTS、CXXC、BAH1、BAH2和MTase域分别以浅蓝色、深红色、浅绿色、深绿色和橙色着色。氨基酸原子表示为透明的范德华球体。锌（II）离子和S公司-据报道，腺苷-l-高半胱氨酸（AdoHcy）配体是根据原子类型着色的球体。包围区域在面板中详细报告（B），其中文本中引用的残基以棒状表示法报告（涉及突变的残基用粗体表示）。红色虚线表示氢键，黑色虚线表示协调键。文中引用的疏水核由Ala570（554）、Val574（558）、Ile601（585）、Ala604（588）、Val606（590）和Leu608（592）组成。（C）人甲基转移酶活性野生型（WT）和突变体DNMT1（DNMT1）表达于大肠杆菌.DNMT1（DNMT1）用ELISA样比色法测定每毫克蛋白质的活性。分析了三个生物重复，数据表示为WT的%DNMT1（DNMT1）活性（平均值±SEM）。EV：空矢量。（D）蛋白质印迹DNMT1（DNMT1）成纤维细胞中磷酸化AKT（Ser473）和GSK3-β（Ser9）；GAPDH、总AKT和GSK3-β用作负荷对照。每个蛋白质都显示了三个独立实验的代表性印迹，分析了三个生物复制品。（E）三个独立的蛋白质印迹实验的密度测定DNMT1（DNMT1）内容。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（F）DNMT1（DNMT1）通过qPCR评估基因表达。TUBB公司作为参考基因。折叠变化表示为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物重复。（G和H）磷酸化AKT和GSK3-β水平的三个独立的western blot实验的密度测定，分别针对总AKT和谷胱甘肽激酶3-β。所有数值均为平均值±SEM，并标准化为对照细胞。DNMT1（DNMT1）mut代表六个突变体的平均值。浅灰色和深灰色分别代表ADCA-DN和HSN-IE表型。未付款t吨测试用于DNMT1（DNMT1）mut与对照，Anova检验（Dunnett的多重比较检验）用于单个突变体与对照。*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001.
图2
图2
DNMT1（DNMT1）线粒体定位和线粒体DNA甲基化分析。（A）和B）蛋白质印迹DNMT1（DNMT1）原代或永生化成纤维细胞的总裂解物（TL）、核（NF）、细胞质（CF）和线粒体（MF）部分的定位（A）或HeLa和SK-N-SH细胞（B）HDAC1和COXIV分别用作核或线粒体部分的标记物。IMM：永生化成纤维细胞。（C）对HeLa和SK-N-SH纯化线粒体进行蛋白酶K保护试验。MFN2、TIM23和CS用作外膜、内膜和基质的标记物。PK：蛋白酶K（ug）；DIG：洋地黄素。（D）和E）用BamHI消化法将线粒体DNA线性化后，用亚硫酸氢-NGS评估线粒体D-loop CpG甲基化。对于L链的每个核苷酸位置，数据表示为测序的总mtDNA分子上甲基化胞嘧啶百分比的平均值±SEM（D）和H股（E）.
图3
图3
线粒体生物发生评估。（A）从头开始线粒体翻译评估35S-蛋氨酸掺入。考马斯染色作为负荷对照。显示了三个独立实验的代表性印迹，分析了三个生物复制品。（B）新合成线粒体蛋白的三个独立实验的密度测定。DNMT1（DNMT1）mut和单个突变值表示为平均值±SEM，并归一化为对照细胞。（C）OXPHOS亚基的Western blot；GAPDH被用作负荷控制。显示了五个独立实验的代表性印迹，分析了五个生物复制品。（D）OXPHOS亚单位的五个独立western blot实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（E）通过qPCR评估mtDNA含量。所有值均表示为四个独立实验的平均值±SEM，并归一化为对照细胞。（F）用qPCR评估PGC-1α基因表达。大号作为参考基因。折变表示为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（G）P53、TIM23、TOM20和柠檬酸合成酶（CS）的Western blot；GAPDH被用作负荷控制。显示了分析生物复制品的独立实验的代表性印迹（6个用于P53，5个用于TIM23，3个用于TOM20和3个用于CS）。（H）P53含量的六个独立western印迹实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（一）TIM23含量的五个独立western blot实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（J）TOM20含量的三个独立western blot实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（K）CS的三个独立western印迹实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。未付款t吨-测试用于DNMT1（DNMT1）mut与对照，Anova检验（Dunnett的多重比较检验）用于单个突变体与对照。*P（P）≤0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001.
图4
图4
OXPHOS功能和线粒体氧化应激的评估。（A）基础状态和注射寡霉素（O）、FCCP（F）、鱼藤酮（R）和抗霉素A（A）后的OCR。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（B）基础呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（C）OCR/ECAR比率。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品并在对照细胞上进行归一化。（D）细胞ATP定量。图中显示了对照细胞上突变体发光信号的比率。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（E）在存在CI、CII、GPD或CIII底物的情况下，评估洋地黄素渗透细胞中的ATP合成速率，并根据CS活性进行标准化。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析生物复制品并在对照细胞上进行标准化。（F）线粒体H2O（运行）2以MitoP/MitoB比率表示的水平。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物重复，并在对照细胞上进行归一化。（G）MnSOD的Western blot；GAPDH被用作负荷控制。显示了四个独立实验的代表性印迹，分析了四个生物复制品。黑条表示在该印迹上删除了一个泳道（一个ctrl样品）。（H）四个MnSOD含量的独立western blot实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。未付款t吨-测试用于DNMT1（DNMT1）mut与对照，Anova检验（Dunnett的多重比较检验）用于单个突变体与对照。*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001.
图5
图5
“嘌呤代谢”的代谢物发生改变。“嘌呤代谢”的示意图，通过靶向代谢组学进行量化。ND：未检测到。浓度表示为pmol/106单元格和显示为平均值±SEM。
图6
图6
改变了“精氨酸和脯氨酸代谢”和“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”的代谢物。“精氨酸和脯氨酸代谢”和“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”的示意图，通过靶向代谢组学进行量化。ND：未检测到。浓度表示为pmol/106单元格和显示为平均值±SEM。未成对t吨Welch校正试验用于DNMT1（DNMT1）mut与控制，*P（P）≤0.05,**P（P） < 0.01.
图7
图7
代谢改变的分子和生物能量学验证。（A）细胞外黄嘌呤在对照培养基和DNMT1（DNMT1）突变体成纤维细胞。数据是三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（B）用比色法测定对照组和对照组培养基中的细胞外尿素DNMT1（DNMT1）突变体成纤维细胞。数据是三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（C）通过dd-PCR评估CPS1基因表达。GAPDH作为参考基因。数据是三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（D）ASS1蛋白印迹；GAPDH公司用作加载控件。显示了三个独立实验的代表性印迹，分析了三个生物复制品。（E）ASS1含量的三个独立western blot实验的密度测定。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（F）通过dd-PCR评估PHGDH基因表达。GAPDH公司作为参考基因。数据是三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（G）ECAR在基础状态和注射葡萄糖（G）、寡霉素（O）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）后进行追踪。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（H）糖酵解和糖酵分解能力。所有值均为三个独立实验的平均值±SEM，分析三个生物复制品。（一）细胞能量状态表示为AMP/ATP比率。数值为CTRLS（n）的平均值±SEM = 4） 和DNMT1（DNMT1）mut（n = 6） 或针对单个突变体的单一措施。（J）磷酸化RAPTOR（Ser792）、磷酸化S6蛋白（Ser204/244）、总S6和DEPTOR的Western blot；总RAPTOR和GAPDH被用作负荷控制。显示了三个独立实验的代表性印迹，分析了三个生物复制品。（K）三个独立的western blot实验的密度测定显示磷酸化RAPTOR在总RAPTOR上的水平。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。（左）通过AlphaLisa分析评估磷酸化S6K蛋白水平，并将分析的蛋白归一化为μg。所有值均为两个独立实验的平均值±SEM。（百万）和否）三个独立的蛋白质印迹实验的密度测定显示磷酸化S6水平对总S6和DEPTOR含量的影响。所有值均为平均值±SEM，并归一化为对照单元格。未付款t吨测试用于DNMT1（DNMT1）mut与对照，Anova检验（Dunnett的多重比较检验）用于单个突变体与对照。*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01,***P（P） < 0.001.
图8
图8
疾病发病机制的模型DNMT1（DNMT1）突变。DNMT1（DNMT1）突变导致DNMT1（DNMT1）蛋白通过激活AKT和GSK3-β抑制。作为核DNA甲基化改变的一个可能结果，嘌呤降解被刺激，NH的生成增加4，一种神经毒性副产品。NH过量4被尿素循环清除，导致ATP短缺。为了进行补偿，刺激OXPHOS以维持ATP请求，触发H2O（运行）2生产过剩。同时，PHGDH的上调将葡萄糖导向丝氨酸合成，限制糖酵解并进一步影响细胞ATP。与PHGDH过度表达相关的谷氨酰胺缺乏导致α-酮戊二酸的产生，可直接进入TCA循环，从而为OXPHOS提供底物，从而导致线粒体功能亢进。在携带最严重病毒的细胞中DNMT1（DNMT1）突变，低ATP激活AMPK，而AMPK反过来抑制mTORC1以限制其他ATP消耗机制。红色箭头：上调；蓝色箭头：下调；虚线箭头：未显示中间反应；3-PG:3-磷酸甘油酯；GLN：谷氨酰胺；GLU：谷氨酸；α-KG：α-酮戊二酸；Ac-CoA：乙酰-CoA。
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    1. Forbes S.A.、Beare D.、Boutselakis H.、Bamford S.、Bindal N.、Tate J.等人（2017）COSMIC：高分辨率体细胞癌遗传学。《核酸研究》，45，D777–D783。doi:10.1093/nar/gkw1121。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Winkelmann J.、Lin L.、Schormair B.、Kornum B.R.、Faraco J.、Plazzi G.等人（2012年）DNMT1突变导致常染色体显性小脑共济失调、耳聋和嗜睡症。嗯，分子遗传学。，21, 2205–2210. doi:10.1093/hmg/dds035-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
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