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.2019年11月；23(6):519-528.
doi:10.4196/kjpp.2019.23.6.519。 Epub 2019年10月24日。

线粒体DNA含量的改变调节成肌细胞中抗氧化酶的表达和氧化应激

Kyung-Ho Min先生 1, 万利 1 2
附属公司

线粒体DNA含量的变化调节成肌细胞中抗氧化酶的表达和氧化应激

Kyung-Ho Min先生等。 韩国生理药理学杂志. 2019年11月.

摘要

线粒体功能障碍与细胞内活性氧（ROS）的产生和氧化应激密切相关。另一方面，线粒体DNA（mtDNA）含量的变化对细胞抗氧化防御系统的调节在很大程度上是未知的。为了确定细胞mtDNA含量与抗氧化应激防御系统之间的关系，本研究检测了一组含有耗尽或还原mtDNA含量的成肌细胞。细胞mtDNA含量的变化调节了成肌细胞中抗氧化酶的表达。尤其是谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶的表达和活性与成肌细胞mtDNA含量呈负相关。线粒体DNA的耗竭使还原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）都略有下降，而细胞氧化还原状态（通过GSH/GSSG比率评估）与对照组相似。有趣的是，依赖于活性氧生成和解毒之间的相互作用的细胞内活性氧的稳态水平显著降低，H2O（运行）2肌母细胞中线粒体DNA缺失可缓解。因此，这些结果表明，ROS稳态和抗氧化酶受细胞mtDNA含量的调节，并且通过mtDNA缺失增加GPx和过氧化氢酶的表达和活性与减轻成肌细胞的氧化应激密切相关。

关键词：抗氧化剂；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶；线粒体DNA；成肌细胞；活性氧物种。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。溴化乙锭（EtBr）对线粒体DNA（mtDNA）含量、功能线粒体和ATP水平的影响。
（A） 从对照中分离出基因组DNA(C类)，mtDNA耗尽(D类)和-已还原(对)通过PCR扩增成肌细胞和线粒体DNA编码基因，如细胞色素c氧化酶亚基I（COX-I）、亚基II（COX-II）和核DNA编码基因（如细胞色素c氧化酶亚基IV（COX-IV）。（B） 从成肌细胞中提取总RNA，并通过以下方法量化mRNA水平q个逆转录聚合酶链反应。密度被标准化为β-肌动蛋白信号，相对强度以任意单位表示，其中对照的强度被设置为100。***p<0.001。（C） 为了分析功能性线粒体，用MitoTracker对对照组、mtDNA-缺失和-回复的L6-GLUT4myc成肌细胞进行染色。放大倍数为~×400。（D） 通过荧光素-荧光素酶试验测定细胞总ATP水平。所有结果都代表了来自五个独立实验的平均值±SEM。***p<0.001与。控件。
图2
图2。线粒体DNA（mtDNA）缺失对抗氧化防御酶转录物的影响。
制备来自对照、mtDNA缺失（耗尽）和-回复（回复）成肌细胞的总RNA。通过RT-PCR（A）和q个RT-PCR（B）。以β-肌动蛋白为对照。所有结果均代表五个独立实验的平均值±SEM。GR，谷胱甘肽还原酶；谷胱甘肽过氧化物酶；谷胱甘肽S-转移酶；超氧化物歧化酶。***p<0.001与。控件。
图3
图3。线粒体DNA（mtDNA）缺失对谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶表达和活性的影响。
在对照、mtDNA缺失（耗尽）和-还原（还原）成肌细胞中制备总细胞裂解物。（A–C）通过免疫印迹分析GPx和过氧化氢酶的表达水平。密度归一化为β-肌动蛋白信号，相对强度以任意单位表示，其中控制强度设置为1。（D） 使用谷胱甘肽还原酶偶联酶程序测量总GPx活性。利用从NADPH标准中获得的消光系数计算比活度。（E） 通过监测10 mM H的分解来测量总过氧化氢酶活性2O（运行）2在240 nm的介质中。一个单位的过氧化氢酶分解1 mM的H2O（运行）2每分钟的数值表示为四个独立实验的平均值±SEM。GR，谷胱甘肽还原酶；超氧化物歧化酶。***p<0.001与。控件。
图4
图4。线粒体DNA（mtDNA）缺失对还原性谷胱甘肽（GSH）或氧化性谷胱甘肽（GSSG）含量和谷胱甘苷S-转移酶（GST）活性的影响。
（A，B）在对照组、mtDNA-缺失（耗尽）和-回复（回复）成肌细胞中测量细胞GSH和GSSG含量。（C） 细胞氧化还原状态表示为GSH/GSSG比率。（D） 在细胞裂解物的上清液中检测GST活性，并使用已知的消光系数计算GST活性。数值表示为三个独立实验的平均值±SEM。**p<0.01与。控件。
图5
图5。线粒体DNA（mtDNA）缺失对细胞活性氧（ROS）含量和H的影响2O（运行）2-诱导细胞死亡。
（A） 使用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针分析对照组、mtDNA缺失（耗尽）和还原（还原）成肌细胞的细胞ROS含量。通过共焦显微镜观察荧光图像（激发，485 nm；发射，530 nm）。从50个细胞获得的相对荧光强度以任意单位表示，其中控制强度设置为1。（B） 线粒体ROS（mt ROS）水平也由线粒体SOX测定。用激发（510 nM）和发射（580 nM）波长测定荧光强度。（C，D）对照（圆形）、mtDNA缺失（三角形）和回复（矩形）成肌细胞与0、25、250或500 mM H孵育2O（运行）224小时。h的影响2O（运行）2-用MTT还原试验（C）和LDH释放（D）评估诱导的细胞死亡，如方法所述。MTT减少的结果表示为百分比变化，其中不含H的成肌细胞的吸光度2O（运行）2设置为100。通过测定释放到培养基中的LDH的活性来测定LDH的释放。所有结果均代表四个独立实验的平均值±SEM。***p<0.001；**p<0.01与。控件。
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参考文献

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