LINC00472 Acts as a Tumor Suppressor in NSCLC through KLLN-Mediated p53-Signaling Pathway via MicroRNA-149-3p and MicroRNA-4270

doi:10.1016/j.omtn.2019.06.003

.2019年9月6日17:563-577。

doi:10.1016/j.omtn.2019.06.003。 Epub 2019年6月15日。

LINC00472通过KLLN介导的p53信号通路通过MicroRNA-149-3p和MicroRNA-4270在NSCLC中发挥肿瘤抑制作用

邹爱美¹, 刘兴利¹, 宗炯麦², 张俊科¹, 刘卓焕¹, 齐鲁·黄^三, 吴爱兵⁴, 周晨雨⁵

附属公司

¹华南医科大学顺德医院肿瘤科（顺德第一人民医院），佛山528308，中国。
²中国广东省湛江市农垦中心医院肿瘤化疗科7区，邮编：524001。
^三广东医科大学附属医院肿瘤科，湛江524001。
⁴广东医科大学附属医院肿瘤科，湛江524001。电子地址：wab80106@163.com。
⁵华南医科大学顺德医院肿瘤科（顺德第一人民医院），佛山528308，中国。电子地址：zhouchengyu1966@21cn.com。

PMID： 31382188
PMCID公司： PMC6676247型
内政部： 2016年10月10日/2011年6月31日

LINC00472通过KLLN介导的p53信号通路通过MicroRNA-149-3p和MicroRNA-4270在NSCLC中发挥肿瘤抑制作用

邹爱美等。摩尔热核酸. 2019.

.2019年9月6日17:563-577。

doi:10.1016/j.omtn.2019.06.003。 Epub 2019年6月15日。

作者

邹爱梅¹, 刘兴利¹, 宗炯麦², 张俊科¹, 刘卓焕¹, 齐鲁·黄^三, 吴爱兵⁴, 周晨雨⁵

附属公司

¹华南医科大学顺德医院肿瘤科（顺德第一人民医院），佛山528308，中国。
²中国广东省湛江市农垦中心医院肿瘤化疗科7区，邮编：524001。
^三广东医科大学附属医院肿瘤科，湛江524001。
⁴广东医科大学附属医院肿瘤科，湛江524001。电子地址：wab80106@163.com。
⁵华南医科大学顺德医院肿瘤科（顺德第一人民医院），佛山528308，中国。电子地址：zhouchengyu1966@21cn.com。

PMID： 31382188
PMCID公司： PMC6676247型
内政部： 2016年10月10日/2011年6月31日

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撤回通知：LINC00472通过KLLN介导的p53信号通路通过MicroRNA-149-3p和MicroRNA-4270在非小细胞肺癌中发挥肿瘤抑制作用。
邹A，刘X，麦Z，张J，刘Z，黄Q，吴A，周C。邹A等人。摩尔热核酸。2022年5月10日；28:597. doi:10.1016/j.omtn.2022.05.016。eCollection 2022年6月14日。摩尔热核酸。2022 PMID：35614992 免费PMC文章。

摘要

据报道，长非编码RNA和小RNA（miRNAs）参与了非小细胞肺癌（NSCLC）的进展。发现长基因间非蛋白编码RNA 472（LINC00472）、miR-149-3p和miR-4270参与肿瘤活动，提示其在非小细胞肺癌中可能发挥作用。因此，本研究旨在检测LINC00472在miR-149-3p和miR-4270参与下影响非小细胞肺癌进展的能力。最初，识别出差异表达的长非编码RNA（lncRNAs）、下游调节性miRNAs和与非小细胞肺癌相关的基因。接下来，测定LINC00472、miR-149-3p和miR-4270以及KLLN和p53信号途径之间的相互作用。通过功能获得和功能丧失实验检测LINC00472对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响。最后，在体内评估了LINC00472对NSCLC肿瘤生长的影响。发现LINC00472和KLLN呈低水平，而miR-149-3p和miR-4270在NSCLC中高表达。此外，观察到LINC00472的过度表达上调了KLLN并激活了p53信号通路，最终通过miR-149-3p和miR-4270抑制了NSCLC细胞的侵袭、迁移和EMT，相应地，N-cadherin和Vimentin减少，E-cadherin增加。LINC00472的过表达对体内肿瘤生长具有抑制作用。综上所述，关键证据表明，LINC00472的过度表达可以下调miR-149-3p和miR-4270，从而上调KLLN并激活p53信号通路，从而抑制NSCLC的发展。本研究强调了LINC00472作为非小细胞肺癌治疗的一个有希望的治疗靶点的潜力。

关键词：KLLN公司；上皮-间充质转化；入侵；长基因间非蛋白编码RNA 472；microRNA-149-3p；微小RNA-4270；迁移；非小细胞肺癌；p53信号通路。

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数字

图1
LINC00472在NSCLC细胞中低表达，主要在细胞质和细胞核中表达（A）GEO中差异表达的LINC00471和其他三种lncRNA的折叠变化：GSE44077标准（B）非小细胞肺癌相关微阵列数据中四种lncRNA的表达，GEO：GSE44077标准横坐标代表lncRNA的名称，纵坐标代表微阵列数据中的lncRNA表达；绿色方框图表示正常样本，红色方框图表示肿瘤样本*p<0.005，***p<0.0001。（C）用qRT-PCR检测119例人非小细胞肺癌组织及邻近正常组织中LINC00472的表达，并用GAPDH标准化*与邻近正常组织相比p<0.05。（D）用qRT-PCR检测LINC00472在5个NSCLC细胞系和人正常肺上皮细胞系（BEAS-2B）中的相对表达，用GAPDH标准化*与BEAS-2B细胞相比，p<0.05。（E） Kaplan-Meier曲线显示LINC00472与非小细胞肺癌患者疾病预后的相关性。（F）通过RNA-FISH检测的NCI-H1299细胞中LINC00472表达的定位（原始放大倍数，×400；比例尺，25μm）。代表性测量数据表示为平均值±SD。非小细胞肺癌组织与邻近正常组织的比较采用配对t检验。多组间的比较采用单因素方差分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；RNA-FISH，RNA-荧光就地杂交。

图2
LINC00472的过度表达抑制NCI-H1299细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。用oe-LINC00472-oe-NC转染NCI-H129细胞。（B） western blot分析检测EMT相关标记的表达。（C） EdU法检测各组细胞增殖情况（原始放大倍数为×200）。（D） Transwell法检测各组细胞的迁移和侵袭（原始放大倍数为×200）*与oe-NC组相比，p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的比较通过非配对t检验进行分析。多组间的比较采用单因素方差分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；上皮-间充质转化；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

图3
用sh-LINC00472或sh-NC转染NCI-H1299细胞后，LINC00472的沉默促进NCI-H129细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。（B）通过western blot分析检测EMT相关标记的表达，并通过GAPDH标准化。（C） EdU法检测各组细胞增殖情况（原始放大倍数为×200）。（D） Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭（原始放大倍数为×200）*与sh-NC组相比，p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的比较通过非配对t检验进行分析。多组间的比较采用单因素方差分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；上皮-间充质转化；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

图4
LINC00472的过度表达通过调节miR-149-3p和miR-4270上调KLLN的表达。NCI-H1299细胞中的表达用miR-149-3 p模拟物或miR-4270-模拟物单独转染NCI-H1290细胞或用oe-LINC0472转染。（A） LINC00472下游调节性miRNAs的预测。左圈表示RNA22数据库的预测结果，右圈表示GEO：GSE53882标准芯片分析结果，重叠部分表示两组数据的交集。（B） miR-149-3p和miR-4270的RNA22数据库分别预测与LINC00472和KLLN的结合位点，miR-149-4p和miR4270的TargetScan分别预测与LINC00472及KLLN结合位点。（C） qRT-PCR显示组织和细胞中miR-149-3p和miR-4270的表达，经U6标准化*与邻近正常组织或BEAS-2B细胞相比，p<0.05。（D） miR-149-3p和miR-4270分别与LINC00472的相关分析。（E） qRT-PCR显示LINC00472过度表达或沉默对miR-149-3p、miR-4270和KLLN的影响，并通过U6或GAPDH标准化*与oe-NC组相比p<0.05，与sh-NC组相比p<0.05。（F） qRT-PCR显示miR-149-3p和miR-4270的过度表达或沉默对KLLN表达的影响，通过U6或GAPDH标准化*与NC模拟组相比p<0.05，与NC抑制剂组相比p<0.05。（G）显示分别与WT-LINC00472、mut-LINC0442、WT-KLLN和mut-KLLN联合转染的NC模拟物、miR-149-3p模拟物和miR-4270模拟物的荧光强度的双荧光素酶报告分析*与NC模拟组相比p<0.05。（H） RIP测定显示miR-149-3p和miR-4270分别与LINC00472或KLLN结合*与抗IgG组相比，p<0.05。（一） qRT-PCR和western blot分析显示KLLN的表达*与NC模拟组相比p<0.05，与miR-149-3p模拟+oe-NC组或miR-4270模拟+oe-NC组相比p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±SD。非小细胞肺癌组织与邻近正常组织的比较采用配对t检验，两组间的其他比较采用非配对t检验。多组间的比较采用单因素方差分析。分别在miR-149-3p、miR-4270和LINC00472之间进行皮尔逊相关分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；miR-149-3p，microRNA-149-3p；miR-4270，microRNA-4270；RIP，RNA结合蛋白免疫沉淀。

图5
LINC00472的过度表达通过抑制miR-149-3p和miR-4270抑制NCI-H1299细胞的EMT、迁移和侵袭。NCI-H1290细胞的表达通过miR-149-3 p模拟物或miR-4270-模拟物单独或oe-LINC00472.转染。（A） qRT-PCR和western blot分析显示了EMT相关上皮标记物（E-cadherin）和间质标记物（N-cadherin和Vimentin）的表达，并通过GAPDH标准化。（B） EdU分析显示各组细胞增殖（原始放大倍数为×200）。（C和D）Transwell分析显示各组的迁移和侵袭（原始放大倍数为×200）*与NC模拟组相比p<0.05，与miR-149-3p模拟+oe-NC组或miR-4270模拟+oe-NC组相比p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的比较通过非配对t检验进行分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；miR-149-3p，microRNA-149-3p；miR-4270，microRNA-4270；EMT，上皮-间充质转化。

图6
过度表达的LINC00472通过上调KLLN的表达激活p53信号通路以抑制NCI-H1299细胞的EMT、迁移和侵袭。NCI-H1999细胞与oe-LINC00472-sh-NC或sh-KLLN联合转染，以oe-NC或sh-NC为对照。（A）核心靶基因与非小细胞肺癌相关已知基因的相关性分析。图中的每个椭圆代表一个基因，椭圆之间的线表示两个基因之间的相互作用。（B）免疫组化显示KLLN在非小细胞肺癌组织中的表达（原始放大倍数为×400）*与邻近正常组织相比p<0.05。（C） qRT-PCR显示非小细胞肺癌细胞中KLLN的表达，经GAPDH标准化*与BEAS-2B细胞相比，p<0.05。（D） LINC00472与KLLN表达的相关性分析。（E） qRT-PCR显示各组的转染效率。（F） qRT-PCR和蛋白质印迹分析显示p53和上皮标志物（E-钙粘蛋白）以及与EMT相关的间质标志物（N-钙粘蛋白和波形蛋白）的表达，通过GAPDH标准化。（G） EdU分析显示细胞增殖（原始放大倍数为×200）。（H） Transwell分析显示细胞迁移和侵袭（原始放大倍数为×200）*与oe-NC+sh-NC组（E–H）相比，p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±SD。非小细胞肺癌组织与邻近正常组织的比较采用配对t检验，两组间的其他比较采用非配对t检验。多组间的比较采用单因素方差分析。对LINC00472和KLLN进行皮尔逊相关分析。实验重复了三次。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；非小细胞肺癌；上皮-间充质转化；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

图7
过表达LINC00472抑制NCI-H1299细胞的肿瘤生长*在体内*将含有oe-LINC00472或oe-NC的NCI-H1299细胞注入裸鼠体内。（B） qRT-PCR显示两组肿瘤异种移植物LINC00472、miR-149-3p和miR-4270的表达，经U6或GAPDH标准化。（C）免疫组化显示两组肿瘤中相关因子的表达（原始放大倍数为×400）*与oe-NC组相比，p<0.05。代表性测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的比较通过非配对t检验进行分析。通过重复测量方差分析比较不同时间点的数据。LINC00472，长基因间非蛋白编码RNA 472；miR-149-3p，microRNA-149-3p；miR-4270，microRNA-4270；非小细胞肺癌。

图8
LINC00472在非小细胞肺癌中作用的示意图LINC00472-过表达上调KLLN的表达，并通过抑制miR-149-3p和miR-4270的表达进一步激活p53信号通路来抑制非小细胞癌细胞的迁移、侵袭和EMT。

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[2] Liu Y.，Li M.，Zhang G.，Pang Z.MicroRNA-10b过度表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭。2013年《欧洲药典》；18:41.-项目管理委员会-公共医学

[3] 王志霞、卞海波、王建瑞、程志霞、王克美、德伟。人非小细胞肺癌患者血清miRNA-21表达的预后意义。《外科学杂志》。2011;104:847–851.-公共医学

[4] 王志霞、卞海波、王建瑞、程志霞、王克美、德伟。人非小细胞肺癌患者血清miRNA-21表达的预后意义。《外科学杂志》。2011;104:847–851.-公共医学

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