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。2019年5月9日；9(1):7122.
doi:10.1038/s41598-019-43575-y。

内源性APOBEC3B过度表达可在骨髓瘤细胞中产生DNA替换和缺失

山崎裕久 1, 白川浩太郎 1, Tadahiko Matsumoto公司 1, Shigeki Hirabayashi先生 1 2, 村川康弘 2 三, 小林Masayuki Kobayashi 1, 阿纳玛丽亚·丹妮拉·萨卡 1, 川岛康弘 1, 松井裕久 1, 丸山和太郎 1, 福田博文 1, 白川龙太郎 4, Keisuke Shindo公司 1, Masaki Ri先生 5, Iida信介 5, 秋水高丽-近藤 6
附属公司

内源性APOBEC3B过度表达可在骨髓瘤细胞中产生DNA替换和缺失

山崎裕久等。 科学代表。 。

摘要

载脂蛋白B信使核糖核酸编辑酶催化多肽样（APOBEC）DNA胞嘧啶脱氨酶已成为各种癌症中潜在的基因组突变因子。多发性骨髓瘤在进展过程中积累APOBEC特征突变；然而，APOBEC签名获取的机制及其后果仍不明确。在本研究中，我们检测了APOBEC3B（A3B）活性在多发性骨髓瘤中的意义和临床影响。在APOBEC中，只有高表达的A3B与骨髓瘤患者的不良预后相关，与其他已知的不良预后因素无关。定量PCR显示CD138阳性的原发性骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞系表现出显著的A3B表达水平。有趣的是，慢病毒A3B敲除阻止了外源DNA中缺失和功能丧失突变的产生，而在对照细胞中，这些突变随着时间积累。A3B基因敲除也降低了γ-H2AX病灶的基础水平，这表明A3B促进了骨髓瘤细胞中构成性DNA双链断裂。重要的是，在对照shRNA-转导细胞中，我们观察到克隆的产生包含外源基因和骨髓瘤中经常突变的几个内源性基因的不同突变，包括TP53。综上所述，结果表明A3B构成性突变了肿瘤基因组，超出了DNA修复系统的保护，这可能导致骨髓瘤的克隆进化和基因组不稳定。

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数字

图1
图1
APOBEC家族基因在MM/MGUS患者和骨髓瘤细胞系中的表达水平。(一)MM/MGUS患者骨髓CD138阳性细胞的实时PCR分析。对A3B mRNA水平与诊断（健康vs MGUS vs MM）、基因型（D/D vs D/I vs I/I）或疾病状态（新诊断MM[NDMM]vs复发/难治MM[RRMM]）之间的相关性进行统计分析。用HPRT1 mRNA标准化A3B mRNA的相对数量。P（P）数值采用Mann-Whitney U检验（*）、Kruskal-Wallis检验（†）或Jonckheere-Terpstra检验（§）计算。(b条)对7个骨髓瘤细胞系（OPM2、MMK1、U266、RPMI8226、THK72、SKMM1和AMO1）中的APOBEC3家族基因（从A3A到A3H）和AID进行实时PCR。靶mRNA表达水平通过HPRT1 mRNA水平进行标准化。以PBMC的靶mRNA水平作为参考。(c（c）)SUDHL6细胞（阴性对照）、KIS1细胞（阳性对照）和7个骨髓瘤细胞系中A3B的免疫印迹分析。α-管蛋白被评估为内部对照。(d日)在SUDHL6、RPMI8226、THK72、SKMM1和AMO1细胞中使用抗A3B抗体进行荧光免疫染色。通过共焦荧光显微镜（放大630倍）获得图像。
图2
图2
APOBEC3B介导骨髓瘤细胞中外源基因功能的丧失。(一)shRNA慢病毒载体构建的模式。所产生的慢病毒与mCherry和嘌呤霉素抗性基因（puroR）一起转导shRNA。(b条,c（c）)实时PCR(b条)和免疫印迹(c（c）)RPMI8226细胞中A3B水平的结果，这些细胞是用针对A3B的慢病毒shRNA转导的（两种结构：shA3B和shA3B-2）或对照shRNA（两种构造：对照和对照-2）。HPRT1或α-微管蛋白被评估为内部对照。(d日)使用抗A3B shRNA或对照慢病毒转导的RPMI8226细胞的抗A3B抗体进行免疫荧光分析。通过共焦荧光显微镜（放大630倍）获得图像。(e（电子）)体外用抗A3B shRNA或对照慢病毒shRNA转导的RPMI8226细胞中胞苷脱氨酶活性的测定。星号表示断裂的DNA产物。(（f）)用mCherry-shRNA慢病毒转导后第3天和第31天对RPMI8226细胞进行流式细胞术。方框中的数字表示每种情况下mCherry阳性细胞在活细胞中的比例。(克)流式细胞术测定每种shRNA慢病毒转导的活细胞中mCherry阳性细胞比例的时间依赖性变化。(小时)EF1α启动子甲基化检测的代表图。黑圈代表甲基化CpG。阴影框指示删除的区域。EF1α启动子的感觉链和mCherry基因区域的一部分仅供参考。粉红色方框表示DNA双链断点处的微同源性。(我)基因组mCherry的实时PCR。用每种shRNA慢病毒转导后3天和15天检测RPMI8226基因组DNA的表达。亚太经合组织被评估为内部控制。第3天的值用作参考。(j个)全长病毒载体DNA的常规PCR。用每种shRNA慢病毒转导后3天和21天检测RPMI8226基因组DNA的表达。箭头表示慢病毒载体（5200）的两个LTR区域之间的扩增子大小 bp）。
图3
图3
APOBEC3B促进骨髓瘤细胞DNA双链断裂。(一)用对照或A3B shRNA慢病毒转导的RPMI8226和AMO1细胞中γ-H2AX的荧光免疫染色。通过共焦荧光显微镜（放大630倍）获得图像。(b条)基于图像的RPMI8226和AMO1细胞中每个细胞γ-H2AX焦点数量的统计分析(一). 每个样本评估了大约200个细胞。全部P（P）使用Student t检验计算值。(c（c）)用对照或A3B shRNA慢病毒转导的RPMI8226细胞中γ-H2AX的免疫印迹分析。(d日)由α-微管蛋白带强度归一化的（c）的γ-H2AX带强度条形图。
图4
图4
APOBEC3B在慢病毒导入的骨髓瘤细胞基因组DNA中诱导C>T|G>A突变。(一,b条)mCherry基因的3D-PCR分析(一)和嘌呤霉素抗性基因（puroR）(b条)在每个shRNA慢病毒转导后3或21天从RPMI8226基因组DNA中提取。在与每种shRNA慢病毒转导后3天，对AMO1基因组DNA衍生的mCherry基因进行3D-PCR分析也表明(一). (c（c）)在与每个shRNA慢病毒转导后的3天（上面板）和21天（下面板），来自RPMI8226基因组DNA的超编辑mCherry序列的突变矩阵。通过TA克隆和Sanger测序获得序列数据。第一列表示突变前的碱基，第一行表示突变后的碱基。突出显示的方框表示重要的C-to-T或G-to-A替换。mCherry序列的有义链被用作参考。(d日)用WebLogo创建的序列标志指示C-to-T突变位点附近核苷酸的频率。(e（电子）)在与每个shRNA慢病毒转导后21天，对源自RPMI8226基因组DNA的mCherry-T2A-purR基因的3D-PCR产物进行深度测序分析。Y轴表示每个取代在总覆盖率中的比例，X轴表示其在从EF1α启动子到puroR基因的扩增基因中的位置。(（f）)mCherry 3D-PCR产物10个克隆中每个克隆与每个shRNA慢病毒转导后3天的Sanger测序结果示意图。G-to-A替换用绿色表示，C-to-T替换用红色表示，G-to-C替换用浅蓝色表示，A-to-T替代用橙色表示。黑色方块表示单基删除，而虚线表示大型删除。粉红色、紫色或黄色方框表示DNA双链断点处的微同源性。(克)第3D-PCR页EGFP公司在与APOBEC3抑制剂杨梅素（5 μM）和金三羧酸（ATA，1 μM）。我们使用针对APOBEC3B的慢病毒shRNA作为阳性对照。
图5
图5
APOBEC3B对内源性基因具有诱变活性。(一)感兴趣的内源性基因3D-PCR的引物设置。白框表示5′-或3′-UTR序列，黑框表示蛋白质编码序列。白色和灰色三角形分别代表第一套和第二套PCR引物。(b条)用对照或shA3B慢病毒转导后21天从RPMI8226细胞获得的基因组DNA中特定位点的3D-PCR。这些位点包括TP53型从外显子1（Ex1）到内含子1（Int1），从外显基因7（Ex7）到内含物8（Int8）2006年发起人BCL7A型启动子，KRAS公司从内含子1（Int1）到内含子2（Int2）MYC公司基因间区（IGR）。(c（c）)超编辑的变异矩阵TP53型在每个shRNA慢病毒转导21天后，从RPMI8226基因组DNA中获得Ex1到Int1的序列。通过TA克隆和Sanger测序获得序列数据。第一列表示突变前的碱基，第一行表示突变后的碱基。感觉链TP53型用作参考。C-to-T和G-to-A替换突出显示。(d日)用WebLogo创建的序列标志，指示与C-to-T突变位点相邻的核苷酸的频率TP53型Ex1-国际1。(e（电子）)代表性菌落PCR结果TP53型TA克隆后，从Ex1到Int1（左）以及从Ex7到Int8（右）。从在最低变性温度下获得的PCR产物中选择来自对照或shA3B转导细胞的克隆(b条). 箭头表示嵌套PCR产品的完整尺寸TP53型（700 bp和639 bp）。(（f）)3D-PCR产品Sanger测序总结TP53型Ex1-Int1和Ex7-Int8。
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