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.2019年5月7日；27（6）：1666-1674.e4。
doi:10.1016/j.celrep.2019.04.051。

内质网膜蛋白复合物促进登革热和寨卡病毒的生物发生支持感染的非结构多途径跨膜蛋白

大卫·L·林 1, 井上孝文 2, 陈玉杰 三, 伦常 三, 蔡比利（Billy Tsai） 4, 安德鲁·泰伊 5
附属公司

内质网膜蛋白复合物促进登革热和寨卡病毒的生物发生支持感染的非结构多途径跨膜蛋白

大卫·L·林等人。 单元格代表. .

摘要

尽管黄病毒在感染期间与宿主内质网膜蛋白复合物（EMC）的功能协同作用，但对这一观察结果的机制解释尚不清楚。在这里，我们表明EMC促进了登革热病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）非结构多途径跨膜蛋白NS4A和NS4B的生物生成，这是病毒复制所必需的。EMC与NS4B结合并与DENV复制细胞器共定位。映射分析表明，NS4B的两个N端边缘疏水结构域赋予了EMC依赖性。此外，改变这两个边缘疏水域的疏水性可以减轻NS4B对EMC的依赖性。我们证明，在EMC-缺失细胞中，NS4B的生物发生减少，但其稳定性没有降低。我们的数据表明，EMC作为一种多途径跨膜伴侣，需要表达至少两种对黄病毒感染至关重要的病毒编码蛋白，并指出在病毒生命周期中存在一个共同的脆弱性，可用于抗病毒治疗。

关键词：内质网膜蛋白复合物；寨卡病毒；登革热病毒；内质网；黄病毒。

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数字

图1。
图1.DENV需要EMC进行复制
用编码Cas9核酸酶的pLentiCRISPRv2慢病毒载体和靶向sgRNA稳定地转导Huh 7.5.1细胞，以敲除指示基因或针对GFP的非靶向（NT）sgRNA对照。（A） 实心圆圈：每个基因使用两个独立的sgRNA。然后用荧光素酶报告物DENV（luc-DENV）感染细胞，并在感染后3天测量荧光素酶活性作为相对光单位（RLU）。开环：对于EMC3，用EMC3 siRNA或干扰阴性对照siRNA转染细胞。转染后2天，用luc-DENV感染细胞，感染后3天测定荧光素酶活性。（B） 表达三种不同sgRNAs靶向EMC6或NT对照的细胞被转染在体外编码荧光素酶报告子DENV复制子的转录RNA。复制通过转染后48小时与4小时荧光素酶活性的比值进行评估，以控制转染和翻译效率的差异。（C） 将EMC6敲除细胞转导表达sgRNA-耐药HA标记的EMC6，然后感染luc-DENV，并在感染后3天测定荧光素酶活性。用指示的抗体裂解重复的孔进行免疫印迹。数据以相对荧光素酶单位（RLU）作为NT的百分比绘制。每个点代表一个生物复制，条形图显示相对于表达非靶向sgRNA对照的细胞的平均值±SD。使用Mann-Whitney U检验确定与NT相比的统计显著性（*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005）。另请参见图S1和S2。
图2。
图2.黄病毒NS4A和NS4B依赖EMC进行高效表达
随后，将稳定表达Cas9核酸酶和靶向EMC6的sgRNA的（A–D）293T细胞池与编码HA-标记的DENV非结构蛋白和NS1-FLAG（A、C和D）或GFP（B）的构建物瞬时共转染，作为转染对照。（E） ImageJ（NIH）用于量化EMC6敲除细胞中每个DENV非结构蛋白的western blot的带强度，并与来自（A）–（D）的野生型进行比较。每个点代表一个生物复制。Bars代表平均值±SD。进行Mann-Whitney U检验以评估统计显著性（与NS1相比，*p<0.05和**p<0.005）。用抗EMC1或干扰阴性对照（scr）的siRNA转染（F–K）HEK293细胞。48小时后，用复制缺陷型全长ZIKV cDNA（F和G）或编码单个S标记ZIKV非结构蛋白NS5（H）、NS4A（I）、NS4 B（J）或NS2B（K）的质粒转染细胞。（G）中的星号表示非特定背景带。对于转染后24小时的（A）-（D）和（F）-（K），用SDS-PAGE裂解细胞并分离蛋白质，然后对所示蛋白质进行蛋白质印迹。每个印迹代表至少两个生物复制。另请参见图S3。
图3。
图3 NS4B生物发生需要EMC，但翻译后稳定性不需要EMC
（A） 用打乱或EMC1 siRNA转染HEK293T细胞，然后用S标记的ZIKV NS4B或Derlinl转染。转染后24小时，用脉冲标记细胞[35S] Met/Cys持续20分钟，追赶指定时间。将NS4B-S或Derlin1-S亲和沉淀并进行SDS-PAGE，并使用磷光成像显示放射性标记蛋白。所示为三个生物复制品的代表性图像。（B） 通过磷光成像定量t=0时NS4B-S和Derlin1-S的蛋白质水平。三个生物复制的数据绘制为平均值±标准差。（C和D）标记的NS4B-S蛋白（C）或Derlin1-S蛋白（D）在转染EMC1 siRNA（闭合三角形）或阴性对照扰乱siRNA（开放圆圈）的细胞中的水平在指示的追踪时间进行量化，并在t=0时标准化，以确定生物发生后的降解速率。将三个生物复制品的数据绘制为平均值±SD。（E）野生型或EMC6敲除Huh 7.5.1细胞稳定转导以表达NS4B-HA，然后用10μM MG132处理3 h以抑制蛋白酶体活性。然后用0.02%洋地黄素处理细胞，使质膜渗透并释放细胞质蛋白。收集洋地黄素可溶性上清液，然后对洋地黄不溶物进行1%NP40处理以释放内质网腔蛋白。使用SDS-PAGE分离级分，并通过蛋白质印迹进行可视化。所示为两个独立实验的代表性斑点。
图4。
图4.NS4B与EMC和Translocon子单元的交互
（A） 对稳定携带DENV复制子的Huh 7.5.1细胞进行裂解，并使用抗EMC4抗体或同型对照物对内源性EMC4进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析免疫沉淀物。数据代表三个生物复制。（B） 24小时后，将瞬时转染表达GFP-S或ZIKV NS4B-S的293细胞裂解，用S蛋白结合珠进行亲和纯化，并用所示抗体进行免疫印迹。数据代表两个生物复制。（C） 用FLAG-Sec61β瞬时转染稳定表达DENV复制子的Huh 7.5.1细胞。转染后20小时，制备细胞裂解物并进行抗FLAG免疫沉淀。抗FLAG免疫沉淀使用抗EMC4抗体进行第二轮免疫沉淀。对第二个免疫沉淀进行SDS-PAGE，然后用所示抗体进行免疫印迹。数据代表三个生物复制。（D） 转导稳定的DENV复制子Huh 7.5.1细胞表达EMC4-FLAG。用DAPI核复染对所示抗原进行免疫染色，然后进行共焦显微镜检查。比例尺，10μm。（E） 使用皮尔逊系数定量共定位；每个点代表一个单元格。
图5。
图5.确认EMC依赖性的DENV NS4B域的标识
（A） TMHMM 2.0版算法（Krogh等人，2001）用于预测DENV 2k-NS4B中跨膜螺旋的存在（UniProtKB:P29990）。该图描述了给定残基位于跨膜螺旋内的概率，其中值越大，跨膜概率越大。x轴上所示的氨基酸位置表示每个预测的跨膜结构域的边界，每个预测的跨膜结构域得分高于0.3。（B） 将稳定表达Cas9和sgRNA靶向EMC6的HEK293T细胞联合转染，以表达所示的C末端GFP标记的NS4B突变体和NS1-FLAG作为转染对照。2k-96表示在氨基酸97处的C末端截短。2k-58表示氨基酸59处的C末端截断。Δ32–96表示从32删除到96。转染后20小时，用SDS-PAGE对细胞进行裂解，并用蛋白质印迹法对所示蛋白质进行解析。（C） 与野生型细胞相比，EMC6敲除细胞中NS4B野生型和Δ32–96的带强度。每个点表示转染NS4B-GFP（圆形）或NS4B-HA（三角形）的细胞的生物复制。（D） 改变pTM1和pTM2螺旋疏水性的NS4B突变示意图。推测这两个螺旋都与膜相关，红色代表疏水性，蓝色代表带电和极性亲水残基（中间）。疏水残基对赖氨酸（顶部）的突变预计会导致pTM1和pTM2的膜结合减少。相反，将带电或极性残基突变为亮氨酸（底部）预计会导致pTM1和pTM2插入膜中。（E和F）转染野生型293T细胞或稳定表达Cas9和靶向EMC6的sgRNA的细胞，以表达指示的NS4B-HA突变体，其具有（E）中所示的赖氨酸残基的取代（疏水性较低）和（F）中所示的亮氨酸残基的取代（疏水性较强）。转染后20小时，用SDS-PAGE对细胞进行裂解，并用蛋白质印迹法对所示蛋白质进行解析。印迹是至少三个独立实验的代表。（G） 使用ImageJ对条带进行量化，并用EMC6敲除细胞与野生型细胞条带强度的比值表示。每个点代表一个生物复制，条形代表平均值±SD。三角形代表经过PNGase处理的NS4B印迹的定量，而圆圈代表未经PNGase治疗的NS4B印迹的量化。使用Dunnett检验评估多重比较的统计显著性（与WT NS4B相比**p<0.005和**p<000005）。（H） EMC与Sec61转座子和黄病毒蛋白的相互作用模型。图为黄病毒基因组RNA（左上）由内质网胞浆面的核糖体（蓝色）翻译。跨膜结构域由Sec61易位子（棕色）共翻译插入内质网膜。EMC（黄色）与转座子相关，有助于在蛋白质翻译和/或移位时正确插入和稳定某些跨膜结构域蛋白。DENV和ZIKV的NS4A和NS4B的表达依赖于EMC。当NS5在与NS4A和NS4B相同的多聚蛋白上表达时，黄病毒多肽中的下一个蛋白NS5在EMC缺陷细胞中的表达也会降低，但当其自身表达时则不会。
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